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.2018年2月9日9:9:195。
doi:10.3389/fimmu.2018.00195。 2018年电子采集。

威瑟芬对炎症细胞因子的相关差异调节

附属公司

Withaferin A相关炎症细胞因子的差异调节

西玛·杜比等。 前部免疫. .

摘要

炎症相关细胞因子/趋化因子的作用与多种人类疾病有关。在这里,我们研究了单核细胞衍生的THP-1细胞在使用含有aferin A(WFA)的膳食制剂治疗后释放的炎性细胞因子的调节。三磷酸腺苷刺激的WFA处理的THP-1细胞的培养上清液的基于膜的细胞因子阵列分析显示多种细胞因子/趋化因子的差异调节。使用qPCR在转录水平验证选定的细胞因子/趋化因子组[白细胞介素-1β(IL-1β)、CCL2/MCP-1、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、PDGF-AA、PTX3、胱抑素-3、松弛素-2、TNFRSF8/CD30和ACRP30]。生物信息学转录结合因子分析显示,在一组下调的细胞因子基因启动子中存在核因子κB(NF-κB)。WFA处理THP-1细胞可阻断NF-kB的核转位,并与细胞因子分泌水平降低相对应。为了进一步了解细胞因子/趋化因子的差异表达,我们发现,WFA改变了尼葛霉素诱导的NLRP3和ASC蛋白的共定位,从而抑制caspase-1激活,caspase-2激活负责前炎症细胞因子IL-1β和IL-18的裂解和成熟。这些数据表明,除了多种细胞因子/趋化因子的差异表达外,膳食制剂WFA同时靶向NF-κB和炎症小体复合物,导致IL-1β和IL-18分别受到抑制。综上所述,这些结果为使用WFA进一步探索与炎症疾病相关的细胞因子/趋化因子的抗炎机制提供了理论基础。

关键词:细胞因子/趋化因子;炎症小体;炎症;巨噬细胞;在A中。

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数字

图1
图1
调节不同细胞因子/趋化因子产生水平通过THP-1细胞中含有甲胎蛋白(WFA)。密度为5的THP-1细胞×105细胞/孔接种在六孔板中,存在佛波酯-肉豆蔻酸酯醋酸盐(500纳克/毫升)。隔夜培养后,脂多糖(LPS)(200ng/mL)添加2h、 用三磷酸腺苷(ATP)(1mM)用于30LPS处理的THP-1细胞培养上清液中102种细胞因子的最小值集体分析[(A)对照]用ATP预处理(B)并用WFA处理(C).(D)细胞因子/趋化因子在膜上的斑点位置的示意图,一式两份,带有各自的内部控制。绿色背景的矩形代表WFA治疗后细胞因子/趋化因子的下调(>1.5倍),红色背景的矩形表示WFA处理后细胞因子或趋化因子上调(>1.5倍)。RS,参考点;NC,阴性对照;-,空白(无斑点)。(E)差异表达基因的相对折叠变化(>1.5倍)。像素强度数据的定量分析没有提供P(P)-值来证明显著性水平。
图2
图2
定量实时PCR表达相对mRNA(A)从THP-1细胞中分离出总RNA,如前所述,接种THP-1后加入或不加入甲胎蛋白(WFA)(20µM)处理,并进行实时PCR以验证所鉴定的细胞因子的差异表达。数据显示为GAPDH归一化的相对靶基因表达。(B)通过细胞裂解物上的western blot(上表)和用三磷酸腺苷激发和WFA(20微米)。实验重复两次,独立细胞制备的结果相似。
图3
图3
用维他福林A(WFA)抑制核因子κB(NF-κB)激活。WFA(5,10,20)后脂多糖(LPS)刺激的THP-1细胞的细胞质和细胞核部分的细胞裂解物采用NF-κB、β-肌动蛋白和组蛋白H3(核标记物)抗体对µM)治疗进行蛋白质表达分析。预期分子量为50和65的NF-κB信号分子在细胞溶质和核组分中均观察到kDa。估计规模为18核裂解物中组蛋白H3蛋白的kDa作为内部控制,而非特异性带位于~15细胞质组分中也观察到kDa。β-肌动蛋白(43kDa)作为细胞质裂解物的内部控制。实验进行了两次,从两个独立的细胞制剂中进行了类似的观察。
图4
图4
尼葛霉素刺激THP-1细胞后,维他福林A(WFA)对NLRP3炎性体复合体及其下游靶点蛋白的影响。WFA以剂量依赖的方式抑制IL-18、IL-1β(IL-1β)和caspase-1的生成。脂多糖(LPS)诱导的THP-1细胞(5×105细胞)用尼格瑞辛(10µM),适用于30培养后,不同剂量的WFA(5、10、20µM)添加4h.采集细胞蛋白,用western blot分析测定NLRP3、ASC、前caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白水平,用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定培养上清液中活性caspase-1、IL-1β和IL18的产生。为了进行蛋白质分析,将印迹与不同的靶抗体进行多次杂交。特定蛋白质(NLRP3、ASC、前caspase-1、前IL-18和前IL-1β)每条带的密度除以该特定膜的β-actin带的密度。使用单因素方差分析(ANOVA)对相对密度进行统计比较,以确定统计差异,并显示与LPS治疗(对照)相比的显著水平。数据代表平均值±SE来自三个独立实验。ELISA结果也进行了单向方差分析,与LPS处理相比,显示出显著水平*显著水平;ns,无显著性。
图5
图5
THP-1细胞的共聚焦荧光图像(放大40倍)的表示,分析了在使用nigercin激活NLRP3炎症小体后,膳食制剂与荧光素A(WFA)的作用。ASC和NLRP3蛋白通过使用菁蓝Cy进行可视化TM公司3(红色荧光)和Alexa Fluor 488(绿色荧光)染料标记抗体。DAPI用于核染色。ASC和NLRP3蛋白的合并图像显示炎症小体复合蛋白的共同定位(黄色,用箭头标记)。实验在独立细胞制备中进行了四次。

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