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.2018年2月22日；172（5）：1007-1021.e17。
doi:10.1016/j.cell.2018.01.032。

SETD1A的非催化功能调节细胞周期蛋白K和DNA损伤反应

Takayuki Hoshii先生 1, 保罗·西法尼 2, 冯朝晖 1, 黄春浩 三, 理查德·科赫 4, 陈春伟 1, 克里斯托弗·德莱尼 1, 斯科特·W·洛 5, 亚历克斯·肯西斯 2, 斯科特·阿姆斯特朗 6
附属公司

SETD1A的非催化功能调节细胞周期蛋白K和DNA损伤反应

Takayuki Hoshii先生等。 单元格. .

摘要

MLL/SET甲基转移酶催化组蛋白3赖氨酸4的甲基化，并在发育和癌症中发挥关键作用。我们评估了MLL/SET蛋白，发现SETD1A是急性髓细胞白血病（AML）细胞生存所必需的。突变研究和CRISPR-Cas9结构域筛选表明，酶促SET结构域对AML细胞的存活并不必要，但一个新发现的区域称为“FLOS”（SETD1A上的功能位置）结构域是不可或缺的。FLOS破坏抑制DNA损伤反应基因并诱导p53依赖性细胞凋亡。FLOS结构域作为细胞周期蛋白K结合位点，是细胞周期蛋白K染色体募集和S期DNA修复相关基因表达所必需的。这些数据确定了染色质调节剂SETD1A与不依赖组蛋白甲基化的DNA损伤反应之间的联系，并表明靶向SETD1A和细胞周期蛋白K复合物可能是AML的治疗机会，也可能是其他癌症的治疗机会。

关键词：DNA损伤反应；SETD1A；细胞周期蛋白K；组蛋白甲基转移酶；白血病；转录。

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SAA为Epizyme Inc、Imago Biosciences、C4 Therapeutics提供咨询服务。

数字

图1
图1。白血病细胞存活和H3K4me3修饰需要SET/COMPASS复合物
A.显示的带有GFP报告子的MLL/SET/COMPASS复合亚单位shRNAs在小鼠MLL-AF9白血病细胞中表达。该实验重复2次，每个实验有3个生物重复。B。设置1a对转染了多西环素（dox）诱导的小鼠MLL-AF9白血病细胞的表达进行分析Renilla荧光素酶（第页任)控制或设置1ashRNA（sh设置1a-1和sh设置1a-2). 在给药后4天对细胞进行分析。显示了3个生物复制品的3个独立实验中的1个的代表性数据。C.dox诱导的数量任或设置1a每3天后计数shRNA-表达细胞。该实验重复2次，每个实验有3个生物重复。D.膜联蛋白V+DAPI公司−dox-inducible中的种群任或设置1a在dox后4天评估shRNA-表达细胞。该实验重复2次，每个实验有3个生物重复。E.多克斯诱导型任或设置1a术后4天用May-Grünwald/Giemsa对shRNA-表达细胞进行染色。显示了3个独立实验的代表性图像。下图显示了急变细胞（红色）、单核细胞/巨噬细胞（灰色）和中性粒细胞（黑色）的百分比。F.任正非的Western blot分析(任/任)，设置1b(任/设置1b)，设置1a(设置1a/任)、和Setd1a/b（Setd1a/设置1b)术后4天进行shRNA-表达细胞检测。量化的强度由GAPDH信号标准化，折叠变化显示为与控制的相对值。显示了两个独立实验的代表性图像。G.移植后3周分析PB中GFP+shRNA-表达白血病细胞的百分比。显示了两个独立实验中一个实验的代表性数据。H.绘制了携带dox-inducible shRNA-expressing白血病细胞的受体小鼠的存活率。显示了两个独立实验中一个的代表性数据（n=5/组）。一、膜联蛋白V+DAPI公司−人口任或设置1ashRNA-表达（GFP++，另见图S1N）在移植后3周对骨髓和脾脏中的白血病细胞进行分析。显示了两个独立实验中一个实验的代表性数据（n=4/组）。J。任或设置1a移植后3周，对骨髓中shRNA-表达的白血病细胞进行分类，并用May-Grünwald/Giemsa染色。显示了3个生物复制品的代表性图像。
图2
图2。SETD1A的内部区域编码白血病细胞生存的关键功能域
A.人类SETD1A缺失突变结构如示意图所示。B.使用SETD1A缺失突变体表达的293T细胞进行Western blot分析。这些结构用于以下救援实验。显示了两个独立实验的代表性图像。C.人SETD1A缺失突变体表达小鼠MLL-AF9白血病细胞转染dox诱导小鼠设置1a3′UTR靶向shRNAs。本实验用2个独立的shRNAs进行，每个实验用3个生物复制品重复2次。D.在SETD1A的功能区内发现进化保守的基序，命名为FLOS1-4（右上面板）。用小鼠SETD1A shRNAs转染SETD1A突变表达的小鼠MLL-AF9白血病细胞。本实验用2个独立的shRNAs进行，每个实验用3个生物复制品重复2次。E.用小鼠转染表达空（GFP）、SETD1A野生型（WT）和FLOS1/丙氨酸突变体（F1-5A）的细胞设置1a3′UTR shRNAs和annexin V+DAPI公司−在dox后4天对种群进行分析。本实验用2个独立的shRNAs进行，每个实验用3个生物复制品重复2次。F.以领域为中心的CRISPR战略与设置1a或设置1b诱导型Cas9（iCas9）表达MLL-AF9白血病细胞或NIH3T3细胞中的sgRNAs。每个sgRNA与SETD1A或SETD1B蛋白的相对位置沿x轴显示。空向量或卢比3sgRNAs分别用作阴性或阳性对照。显示了三分之一独立实验的代表性数据。G.实施以领域为中心的CRISPR战略设置1a人类白血病和肉瘤细胞系中的sgRNA。空矢量或RPA3型sgRNAs分别用作阴性或阳性对照。该实验重复2次，每个实验有3个生物重复。
图3
图3。SETD1A FLOS结构域在白血病细胞增殖中发挥非冗余作用
A.相对表达水平设置1a在三苯氧胺治疗后4天，用qRT-PCR对MLL-AF9白血病细胞进行定量。该实验重复3次，每个实验有3个生物重复。用SETD1A突变构建物转染B.MLL-AF9白血病细胞。用三苯氧胺处理细胞，然后检测其克隆形成潜能。显示了2个独立实验中的1个实验和3个生物复制品的代表性数据。C.人类SETD1A和人类SETD1B的嵌合结构如示意图所示。D。设置1a飞行/飞行;CreER公司用SETD1嵌合构建物转染细胞，并用能检测人类SETD1A或SETD1B的Taqman探针定量相对外源基因表达水平。该实验重复2次，每个实验有3个生物重复。用SETD1嵌合构建物转染E.MLL-AF9白血病细胞，并监测三苯氧胺治疗后第4天起3天内细胞数量的增加。该实验重复3次，每个实验有3个生物重复。F.附件五+DAPI公司−人口设置1a飞行/飞行;CreER公司在三苯氧胺治疗后第5天分析表达SETD1嵌合结构的细胞。该实验重复3次，每个实验有3个生物重复。G.中菌落的典型形态设置1a飞行/飞行;CreER公司显示了表达SETD1嵌合结构的细胞。H.单细胞衍生菌落设置1a飞行/飞行;CreER公司表达SETD1嵌合结构的细胞在三苯氧胺治疗后通过克隆形成试验进行分离。设置1a通过PCR对5个克隆的等位基因进行了分型。
图4
图4。SETD1A FLOS结构域调节DNA损伤反应
A.火山图用于描述RNA-seq数据。三个独立样本设置1a+/+和设置1aΔ/Δ对白血病细胞进行分析。GO分析分类的显著下调的DNA修复基因（见图S4A）显示为红点。B.对MLL-AF9白血病细胞的RNA-seq数据进行基因集富集分析。散点图显示了标准化富集分数（NES）和错误发现率（FDR）q值，并与MSigDB策划的基因集富集进行了比较（左）。基因集在设置1aΔ/Δ白血病细胞NES值分别为阳性或阴性。DNA修复基因集的代表性富集图如图所示（右图）。C.进行qRT-PCR分析范迪2中的表达式设置1a飞行/飞行;CreER公司三苯氧胺作用24至120小时后的MLL-AF9白血病细胞。该实验重复3次，每个实验有3个生物重复。D.直方图显示H3K4me3、H3K27Ac和mRNA在范迪2基因座设置1a敲除白血病细胞。用SETD1A突变cDNA转染E.MLL-AF9白血病细胞，并对其进行qRT-PCR分析范迪2在三苯氧胺治疗后4天进行。显示了2个独立实验中的1个实验和3个生物复制品的代表性数据。将SETD1A/B突变cDNA转染MLL-AF9白血病细胞，并对其进行qRT-PCR分析范迪2在三苯氧胺治疗后4天进行。显示了2个独立实验中的1个实验和3个生物复制品的代表性数据。G.图像显示了对照组和设置1a-白血病细胞缺乏。红色箭头表示染色体上的断裂/间隙。见表1。用三苯氧胺处理H.MLL-AF9白血病细胞，并在三苯氧胺后4天通过蛋白质印迹分析分析p53蛋白的表达。一、。第53页带有tRFP657报告子的sgRNA和设置1a将带有GFP报告子的FLOS1 sgRNAs依次转染到表达iCas9的MLL-AF9白血病细胞中。显示了2个独立实验中的1个实验和3个生物复制品的代表性数据。J。设置1a带有GFP报告子的FLOS1 sgRNAs被转导到第53页表达MLL-AF9白血病细胞的−/−衍生iCas9。显示了2个独立实验中的1个实验和3个生物复制品的代表性数据。用p53 shRNA转染K.MLL-AF9白血病细胞，并用三苯氧胺处理24小时。的相对表达水平范迪2在三苯氧胺治疗后4天通过qRT-PCR进行定量。显示了2个独立实验中的1个实验和3个生物复制品的代表性数据。
图5
图5。SETD1A FLOS域结合细胞周期蛋白K
A.SETD1A结合蛋白通过Co-IP MS鉴定。蛋白质通过银染（左）显示并从凝胶中切除。在GO分析中，68个蛋白质被鉴定为SETD1A-结合蛋白（右框用灰色勾勒），11个蛋白质被归类为DNA损伤反应相关蛋白（红色圆圈）。信号强度等级如括号所示。用SETD1A缺失突变体构建物转染B.293T细胞，并将蛋白提取物用于Co-IP实验。用SETD1A构建物的内部区域特异性片段转染C.293T细胞。左侧所示的标记有FLAG的碎片用于Co-IP。用SETD1A FLOS1或FLOS2丙氨酸突变体构建物转染D.293T细胞。用SETD1A和SETD1B构建物转染E.293T细胞。SETD1A/B的共同结合伙伴CXXC1被检测为阳性对照。F.H3K4me3阳性TSS下H3K4me3（上部）和CCNK（下部）的平均ChIP-seq信号设置1aΔ/Δ和设置1a+/+白血病细胞。用细胞周期蛋白K突变体转染G.293T细胞。左图所示的标记有FLAG的细胞周期蛋白K突变体用于Co-IP。
图6
图6。SETD1A调节MLL-r白血病细胞周期蛋白K/CDK12轴
A.使用以领域为中心的CRISPR策略来分析Ccnk公司小鼠MLL-AF9白血病细胞中的基因。显示了三分之一独立实验的代表性数据。B。2013年12月12日激酶域-用RFP报告子靶向sgRNAs，用于iCas9-表达的MLL-AF9白血病细胞的竞争性生长分析。显示了2个独立实验中的1个实验和3个生物复制品的代表性数据。C.对表达iCas9的MLL-AF9白血病细胞进行RNA-seq分析Ccnk公司sgRNAs。四个独立的Ccnk公司使用sgRNAs。下调基因之间的重叠Ccnk公司sgRNA-表达细胞和设置1a显示了敲除细胞。D.190个常见下调基因的基因本体分析如（C）所示。DNA损伤刺激条显示为红色。E–F。qRT-PCR分析范迪2在里面Ccnk公司sgRNA（E）或Cdk12号机组sgRNA（F）–在dox后4天表达白血病细胞。显示了2个独立实验中的1个实验和3个生物复制品的代表性数据。用FLAG-标记的细胞周期蛋白K或FLAG-标签的SETD1A和CDK12表达载体转染G.293T细胞。用FLAG-tag抗体进行Co-IP实验。显示了两个独立实验的代表性图像。H.Western blot分析用于检查SETD1A-缺陷MLL-AF9白血病细胞中细胞周期蛋白K和RNAP2-CTD（Ser2或Ser5）磷酸化的整体水平。显示了两个独立实验的代表性图像。
图7
图7。SETD1A-Cyclin K调节风扇CD2G1/S期转录
A.SETD1A阳性TSS（n=18396）的SETD1A（红色）和RNAP2（蓝色）的ChIP-seq密度读数任shRNA或设置1a显示了表达shRNA的NIH3T3细胞。根据SETD1A信号强度在任和设置1ashRNA。B.SETD1A阳性TSS的SETD1A（上部）和RNAP2（下部）的平均ChIP-seq信号任shRNA或设置1a图中显示了表达shRNA-的NIH3T3细胞。C.对SETD1A进行ChIP-qPCR范迪2基因座任shRNA（蓝色）或设置1ashRNA（红色）–在dox后4天表达NIH3T3细胞。兔IgG作为ChIP（点线）的阴性对照。显示了3个独立实验和3个生物复制的代表性数据。D.流式细胞术显示FUCCI阳性293T单细胞克隆中的细胞周期阶段（左面板）。每个片段中的DNA含量显示在右侧面板中。通过细胞分选对E.293T-FUCCI细胞进行分离。使用所示抗体进行Western blot分析。显示了3个独立实验的代表性数据。F、。风扇CD2用qRT-PCR监测细胞周期中的转录水平。该实验重复3次，每个实验有3个生物重复。G.在转染后4天分析表达293T-FUCCI细胞的Scramble shRNA（Scr，蓝色）和SETD1A shRNA（红色）。显示SETD1A（左）和FANCD2（右）的表达式。另请参见图S7E。H。风扇CD2转染后4天分析表达Scr shRNA（蓝色）和CCNK shRNA（红色）的293T-FUCCI细胞的转录。另请参见图S7F。一、。风扇CD2在处理后3天分析DMSO（蓝色）和100 nM THZ531（红色）处理的293T-FUCCI细胞中的转录。显示了2个独立实验中的1个实验和3个生物复制品的代表性数据。
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