PU.1/microRNA-142-3p targets ATG5/ATG16L1 to inactivate autophagy and sensitize hepatocellular carcinoma cells to sorafenib

doi:10.1038/s41419-018-0344-0

.2018年2月22日；9(3):312.

doi:10.1038/s41419-018-0344-0。

PU.1/microRNA-142-3p靶向ATG5/ATG16L1使自噬失活并使肝癌细胞对索拉非尼敏感

附属公司

¹中华人民共和国江苏省南京市南京大学医学院金陵医院肿瘤内科。
²中华人民共和国江苏省南京市南京医科大学医学院金陵医院肿瘤内科。
^三中华人民共和国江苏省南京市南京大学医学院金陵医院肿瘤内科。wangrui218@163.com。
⁴中国江苏省南京市南京大学医学院金陵医院临床实验室。zchunni27@hotmail.com。

PMID： 29472524
预防性维修识别码：项目编号5833744
内政部： 10.1038/s41419-018-0344-0

PU.1/microRNA-142-3p靶向ATG5/ATG16L1使自噬失活并使肝癌细胞对索拉非尼敏感

张凯（Kai Zhang）等。细胞死亡疾病. 2018.

.2018年2月22日；9(3):312.

doi:10.1038/s41419-018-0344-0。

附属公司

¹中华人民共和国江苏省南京市南京大学医学院金陵医院肿瘤内科。
²中华人民共和国江苏省南京市南京医科大学医学院金陵医院肿瘤内科。
^三中华人民共和国江苏省南京市南京大学医学院金陵医院肿瘤内科。wangrui218@163.com。
⁴中国江苏省南京市南京大学医学院金陵医院临床实验室。zchunni27@hotmail.com。

PMID： 29472524
预防性维修识别码：项目编号5833744
内政部： 10.1038/s41419-018-0344-0

摘要

索拉非尼是目前唯一批准用于治疗晚期肝细胞癌（HCC）的全身性药物。然而，对索拉非尼的内在和后天耐药性对于改善肝癌患者的预后仍然是一个巨大的挑战。自噬的细胞保护功能被认为是肿瘤细胞发生化疗耐药或靶向耐药的潜在机制。在本研究中，miR-142-3p被鉴定为一种新的自噬调节microRNA（miRNA），在肝癌细胞索拉非尼耐药中起重要作用。功能获得和丧失分析显示，异位miR-142-3p通过减少索拉非尼诱导的自噬、增强索拉非尼诱导的细胞凋亡和抑制细胞生长，上调HCC细胞对索拉非尼的敏感性，而miR-142-3p的抑制则产生了相反的效果。生物信息学分析和荧光素酶报告和拯救试验表明，自噬相关5（ATG5）和自噬相关性16样1（ATG16L1）是miR-142-3p调节自噬抑制的潜在靶点。此外，我们结合我们的细胞实验和文献中的相关结果验证了PU.1调节miR-142-3p的表达。我们的研究结果表明，靶向PU.1-miR-142-3p-ATG5/ATG16L1轴可能是一种有效的治疗策略，可以防止细胞保护性自噬，从而克服索拉非尼耐药性。

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数字

**图1。索拉非尼治疗的肝癌细胞自噬增强。**
一采用Western blotting方法检测索拉非尼和含或不含Baf-A1的肝癌细胞的自噬活性。b条采用Western blotting方法检测用浓度增加的索拉非尼和含或不含Baf-A1处理的肝癌细胞的自噬水平。**c（c）**用GFP-LC3质粒转染SMMC-7721和HepG2细胞，然后用指定浓度的索拉非尼处理24小时 h.治疗结束时，在荧光显微镜下检查细胞。d日利用透射电镜测定自噬体水平。所有数据均表示为平均值 ± 来自三个独立实验的S.D。这个第页-值表示组之间的比较(**第页 < 0.01)

**图2。抑制自噬增强了肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。**
一采用MTT法测定索拉非尼处理的SMMC-7721细胞经3-MA或ATG1/ULK1沉默处理后的相对存活率。b条——**e（电子）**流式细胞术和western blotting检测凋亡率和凋亡（c-caspase3和c-PARP）以及自噬相关蛋白水平。所有数据均表示为平均值 ± 来自三个独立实验的S.D。这个第页-值表示组之间的比较(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01)

**图3。MiR-142-3p可能在索拉非尼治疗期间抑制自噬，并且可能被PU.1上调HCC细胞的自噬。**
一qRT-PCR用于评估索拉非尼处理的SMMC-7721细胞中自噬和凋亡相关miRNA水平。b条采用qRT-PCR和western blotting检测索拉非尼处理的HepG2和SMMC-7721细胞中PU.1的水平。**c（c）**ChIP分析用于确认PU.1与miR-142-3p相互作用。d日PU.1表达载体转染逆转了索拉非尼对miR-142-3p的抑制作用。**e（电子）**在索拉非尼处理后，用miR-142-3p模拟物（左）或抑制剂处理的细胞中测量LC3和p62水平。如果,克索拉非尼诱导的LC3点水平(如果)和自噬空泡(克)在使用miR-142-3p模拟物或抑制剂治疗后进行计数。所有数据均表示为平均值 ± 来自三个独立实验的S.D。这个第页-值表示组之间的比较(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01)

**图4。通过自噬抑制强迫miR-142-3p表达使肝癌细胞对索拉非尼重新敏感。**
一,b条采用MTT法和克隆形成法测定miR-142-3p对不同浓度索拉非尼的细胞毒性和SMMC-7721细胞增殖的影响。**c（c）**采用流式细胞术分析miR-142-3p对不同浓度索拉非尼处理的细胞SMMC-7721凋亡率的影响。d日Western blotting用于评估凋亡和自噬相关蛋白水平。所有数据均表示为平均值 ± 来自三个独立实验的S.D。这个第页-值表示组之间的比较**第页 < 0.01)

**图5。ATG5和ATG16L1是miR-142-3p的直接靶点。**
一测定了ATG5和ATG6（左）的3'-UTR中miR-142-3p的结合位点，并进行荧光素酶报告分析，以确认miR-142-4p与ATG5及ATG16L1之间的关系。b条用qRT-PCR和western blotting检测转染miR-142-3p模拟物或抑制剂的SMMC-7721细胞中ATG5和ATG16L1 mRNA和蛋白水平，并用或不用索拉非尼处理。**c（c）**,d日采用集落形成分析和流式细胞仪分析，检测ATG5和ATG16L对经索拉非尼处理或不经索拉菲尼处理的SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响。**e（电子）**Western blotting检测凋亡和自噬相关蛋白水平。所有数据均表示为平均值 ± 来自三个独立实验的S.D。这个第页-值表示组之间的比较(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01)

**图6。miR-142-3p在索拉非尼耐药中的作用依赖于ATG5和ATG16L1的调节。**
一进行MTT测定以测量用miR-142-3p模拟物和ATG5或ATG16L1共转染的SMMC-7721细胞对索拉非尼的敏感性。b条采用集落形成实验检测miR-142-3p模拟物和ATG5或ATG16L1共转染的SMMC-7721细胞的增殖能力。**c（c）**采用流式细胞术检测miR-142-3p模拟物和ATG5或ATG16L1共转染SMMC-7721细胞的凋亡率。d日Western blotting用于评估miR-142-3p模拟物和ATG5或ATG16L1共同转染的SMMC-7721细胞中凋亡相关蛋白c-caspase-3和c-PARP以及自噬相关蛋白的水平。所有数据均表示为平均值 ± 来自三个独立实验的S.D。这个第页-值表示组之间的比较(**第页 < 0.01)

**图7。MiR-142-3p增强了索拉非尼在肝癌体内的抗肿瘤作用。**
一肿瘤体积的生长曲线和荷瘤小鼠的代表性照片。b条肿瘤和肿瘤重量的代表性照片。**c（c）**通过免疫染色分析索拉非尼治疗后HepG2/miR-142-3p和HepG2/对照异种移植物中ATG5和ATG16L1的表达水平。采用免疫染色和TUNEL染色来测量索拉非尼治疗后来源于HepG2/miR-142-3p和HepG2/对照异种移植物的肿瘤中的PCNA和Ki67水平以及细胞凋亡率。d日通过Western blotting评估索拉非尼治疗后HepG2/miR-142-3p和HepG2/对照异种移植瘤中LC3、ATG5、ATG16L1和p62蛋白的表达。所有数据均表示为平均值 ± 来自三个独立实验的S.D。这个第页-值表示组之间的比较(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01)

**图8。肝癌组织中miR-142-3p的表达与PU.1的表达呈正相关，与ATG5/ATG16L1的表达呈负相关。**
一采用qRT-PCR方法检测38例肝癌组织和匹配正常组织中miR-142-3p、PU.1、ATG5和ATG16L1的水平。b条分析miR-142-3p与PU.1表达的相关性。**c（c）**分析miR-142-3p与ATG5和ATG16L1表达的相关性。d日miR-142-3p/ATG5/ATG16L1调节信号的示意图。所有数据均表示为平均值 ± 来自三个独立实验的S.D。这个第页-值表示组之间的比较(**第页 < 0.01)

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1. Cainap C等人，Linifanib与索拉非尼治疗晚期肝细胞癌患者：一项随机III期试验的结果。临床杂志。昂科尔。2015;33:172–179。doi:10.1200/JCO.2013.54.3298。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
1. Llovet JM等。索拉非尼治疗晚期肝癌。北英格兰。《医学杂志》，2008年；359:378–390. doi:10.1056/NEJMoa0708857。-DOI程序-公共医学
1. Cheng AL等。索拉非尼治疗亚太地区晚期肝癌患者的疗效和安全性：一项III期随机、双盲、安慰剂对照试验。柳叶刀Oncol。2009;10:25–34. doi:10.1016/S1470-2045（08）70285-7。-DOI程序-公共医学

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[6] Cainap C等人，Linifanib与索拉非尼治疗晚期肝细胞癌患者：一项随机III期试验的结果。临床杂志。昂科尔。2015;33:172–179。doi:10.1200/JCO.2013.54.3298。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

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