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.2018年2月22日：7:e32282。
doi:10.7554/eLife.32282。

Rab5和Alsin调节线粒体上应激激活的细胞保护信号

徐福生 1, 斯蒂芬妮·斯潘恩 1, 查尔斯·弗格森 2, 安东尼·海曼 1, 罗伯特·G·帕顿 2 三, 马里诺·泽里尔 1
附属机构

Rab5和Alsin调节线粒体上应激激活的细胞保护信号

徐福生等。 埃利夫. .

摘要

线粒体应激反应对细胞生存至关重要，受损的线粒体是神经退行性疾病的标志。因此，了解线粒体如何在细胞内传递信息是至关重要的。在这里，通过研究线粒体-内体接触位点，我们意外地发现，小GTPase Rab5在氧化应激时从早期内体易位到线粒体。这个过程是可逆的，伴随着与线粒体接触的Rab5阳性内体的增加。有趣的是，线粒体上Rab5的激活依赖于Rab5-GEF ALS2/Alsin，由肌萎缩侧索硬化症（ALS）中突变的基因编码。Alsin缺乏的人诱导多能干细胞源性脊髓运动神经元在将Rab5重新定位到线粒体方面存在缺陷，并表现出对氧化应激的敏感性增加。这些发现定义了一种新的途径，Alsin通过该途径催化Rab5内吞机制在线粒体上的组装。在ALS发病期间，内切体的应力感受缺陷可能对线粒体质量控制至关重要。

关键词：细胞生物学；内吞作用；人；有机体间信号；膜接触位点；贩卖人口。

PubMed免责声明

利益冲突声明

FH、SS、CF、RP、MZ未宣布竞争利益，AH审查编辑，eLife

数字

图1。
图1.线粒体的内膜接触。
(A类)和(B类)用TagRFP-MTS（线粒体靶向序列）转染HeLa细胞，并分别在37℃下用Alexa-488转铁蛋白（Tfn）或表皮生长因子（EGF）标记10分钟。(C类)用米托红染色的HeLa细胞在37°C下用Tfn-488或EGF-488标记10、60分钟，或用250µM H处理2O（运行）2标记10分钟后，再培养50分钟。将显示插入区域。比例尺，10μm。(D类)根据图1C中获得的图像，在Mito-Red和Tfn-488或EGF-488之间进行基于随机共定位减法的共定位分析，n个 = 50. (E类)每个细胞总强度的量化，n个 = 50. 误差条代表SEM。p基于双尾t检验的值。
图2。
图2激光诱导应激时Rab5向线粒体的募集。
(A类)用100 nM Mito-Red在37°C下标记活BAC GFP-Rab5 HeLa细胞30分钟。用561 nM低剂量激光（~5 J/cm）对细胞进行光辐照2)持续60秒。在激光前和激光后20分钟拍摄细胞快照。箭头表示GFP-Rab5阳性内体，靠近线粒体(B类)光照后Mito-Red和GFP-Rab5的显色分析(A类),n个 = 5. 误差条代表SEM。p值基于双尾t检验。(C类)BAC GFP-Rab5 HeLa细胞的活细胞成像(A类). (D类)在30分钟的时间内从插入区域对GFP荧光信号进行定量(C类). (E类)Mito-Red、GFP-Rab5和从插入区域合并的时间段图像(C类). (F类)BAC GFP-Rab5 HeLa细胞的活细胞成像仅光照到标记区域（白盒）。显示激光照射前的电池（Pre）。在激光照射后10分钟和20分钟拍摄细胞快照。插图显示了激光治疗对线粒体形态和网络的影响。箭头表示线粒体（双头）附近GFP-Rab5（填充）和GFP-Rap5阳性内体的补充。比例尺，10μm。
图2——图补充1。
图2-图补充1。线粒体的Rab5募集是线粒体特异性的。
(A类)HeLa细胞在37°C下用100 nM MitoTracker-Green FM（Mito-Green）标记30分钟，并用561 nM激光（~10 J/cm）进行光辐照2)持续60秒。在激光治疗后20分钟拍摄图像。线粒体网络保持管状。(B类)用TagRFP-MTS转染HeLa BAC GFP-Rab5细胞，并用561nm激光（~10J/cm）进行光照射2)持续60秒。在激光治疗后20分钟拍摄图像。(C类)BAC GFP-Rab5细胞接种在网格玻璃皿上，用Mito-Red标记30分钟，像以前一样进行光照，并在激光后30分钟固定。用针对Rab5或TOM20的特异性抗体对细胞进行免疫染色。将显示插入区域。比例尺，10μm。
图2——图补充2。
图2补充图2线粒体上的GFP-Rab5富集持续时间<60分钟。
激光治疗后细胞的时间推移图像，如图2F所示。插入图像显示在不同的时间点（分钟）。箭头表示GFP-Rab5在15分钟内补充到线粒体，持续至少60分钟。标尺为10μm。
图3。
图3 Rab5阳性线粒体和内体之间的膜接触。
激光诱导应力下细胞的超微结构分析。(A类)实验装置的流程图。将BAC GFP-Rab5细胞接种在网格培养皿上，在37°C下用100 nM Mito Red标记30 min。然后用低剂量561 nM激光（~5 J/cm）对感兴趣的细胞进行光辐照2)对GFP-Rab5阳性内体和线粒体之间的活细胞成像进行细胞器动力学评估。在进行EM处理之前，对同一细胞进行重新成像以进行固定后分析(B类)用戊二醛固定后GFP-Rab5和（Mito-Red）的荧光图像。盒区显示GFP-Rab5内体（红色箭头）靠近肿胀的Rab5阳性线粒体。同一电池的透射电子显微照片（TEM）如图所示（右侧面板）。核膜（虚线）和线粒体（红星）用作基准标记。(C类)放大中长方体区域的图像(B类). 彩色图像显示绿色为GFP-Rab5阳性结构，红色为线粒体。原始图像如下所示。线粒体嵴可见。线粒体附近的膜结构可能对应于内质网标尺，500 nm。
图4。
图4激光诱导应力下内源性LC3、Lamp1、Parkin和Bax的定位。
BAC GFP-Rab5细胞在37°C下用100 nM Mito-Red标记30分钟。在激光照射前采集细胞作为对照（未处理）(A类), (C类), (E类)、和(G公司). 与之前相同的细胞进行光照，激光治疗60分钟后固定，并用特异性LC3抗体进行免疫染色(B类)，灯1(D类)、帕金(F类)和Bax(H（H）). 插图显示了激光治疗前后的区域。(我)在未处理和激光诱导的条件下，Mito红与Rab5、LC3、Lamp1、Parkin和Bax的共定位分析(n个 = 3). 未处理的细胞对应于激光处理区域外的细胞。误差条代表SEM。p值基于双尾t检验。比例尺，10μm。
图4-图补充1。
图4补充1。内源性LC3、Lamp1和Parkin在未处理细胞中的定位。
将BAC GFP-Rab5细胞接种在网格玻璃皿上，并在37°C下用100 nM Mito-Red标记30分钟。将细胞固定，并用LC3、Lamp1和Parkin抗体进行免疫染色。从激光处理细胞外的区域拍摄图像。比例尺，10μm。
图4——图补充2。
图4补充图2.BAC GFP-LC3、-Lamp1和-Parkin在激光诱导应力下的定位。
BAC GFP-LC3的活细胞成像(A类)、GFP-LAMP1(B类)和GFP-Parkin(C类)单元格。细胞在37°C下用100 nM Mito-Red标记30分钟，并像以前一样进行光照。显示了相同细胞在激光治疗前（未治疗）和治疗后60分钟的图像。插图显示了激光治疗前后的大致面积。
图4——补充图3。
图4-补充图3.CCCP诱导Bax蛋白在线粒体上的表达和定位。
(A类)用DMSO（Ctrl）或10µM CCCP在37°C下处理标记有100 nM Mito-Red的HeLa细胞2小时。固定细胞并用Bax抗体进行免疫染色。比例尺，10μm。(B类)Ctrl和CCCP处理细胞Bax信号的荧光折叠变化；n个 = 50. 控制单元格中的值标准化为1。(C类)Ctrl与CCCP中Mito-Red和Bax的显色分析。误差条代表SEM。p值基于双尾t检验。
图4——补充图4。
图4-图补充4..tBid过表达导致线粒体上Rab5富集。
用对照腺病毒（Ad-Ctrl）或Ad-tBid在37°C下感染BAC GFP-Rab5细胞12小时。细胞固定并用TOM20抗体进行免疫染色。将显示插入区域。比例尺，10μm。
图5。
图5.影响CCCP与H2O（运行）2Rab5募集到线粒体。
用100nM有丝分裂红标记的BAC GFP-Rab5 HeLa细胞用DMSO（Ctrl）、10μM CCCP处理(A类)，或250μM H2O（运行）237°C下2小时(B类). 通过共焦显微镜对细胞进行固定和成像。插入区域揭示了治疗后对线粒体形态和GFP-Rab5定位的影响。箭头表示CCCP和H中圆形和受力的线粒体2O（运行）2-处理条件。比例尺，10μm。(C类)和(D类)米托红与GFP-Rab5的显色分析(A类)和(B类)分别为；n个 = 50. 误差条代表SEM。p值基于双尾t检验。(E类)用DMSO（Ctrl）、10μM CCCP或250μM H处理的HeLa细胞进行亚细胞分离2O（运行）2在37°C下保存2小时。来自纯化线粒体（Mito）和胞质的蛋白质样品(C类)将组分载入SDS-PAGE并用细胞色素c抗体进行标记。(F类)细胞处理方法与(E类). 然后将细胞重新悬浮在含有500 nM caspase-3/7绿色流式细胞术试剂的活细胞成像溶液中，并在37°C下培养30分钟，然后进行流式细胞仪分析。FITC信号（x轴）根据总细胞计数（y轴）绘制。门控是根据DMSO控制中的背景信号设置的。(G公司)HeLa细胞接种在Seahorse 96-well平板中并培养过夜。在实验开始前，立即将生长培养基换成无碳酸氢盐的低缓冲分析培养基（由制造商提供），并添加10 mM半乳糖。在Seahorse XFe96分析仪中，对仅注入培养基（紫色）、250µM H的细胞进行耗氧率测量2O（运行）2（绿色）或10µM CCCP（橙色）。误差条代表SEM。
图5——图补充1。
图5——图补充1..CCCP，但不包括H2O（运行）2，导致Parkin招募。
(A类)BAC GFP-Parkin或WT-HeLa细胞(B类)用DMSO（Ctrl）、10µM CCCP或250µM H处理2O（运行）2在37°C下放置2小时。通过共焦显微镜对细胞进行固定和成像。用Parkin抗体对HeLa细胞进行免疫染色。将显示插入区域。比例尺，10μm。
图6。
图6。。过氧化氢（H2O（运行）2)治疗减少EE上Rab5膜的结合，增加早期内体-线粒体接触，并减少转铁蛋白的摄取。
(A类)用H处理的HeLa细胞进行亚细胞分离2O（运行）21小时和2小时。总膜(M（M）)将核后上清液在4°C、200000 g的温度下离心1小时，得到部分，上清液作为细胞溶质(C类)分数。将蛋白质样品加载到SDS-PAGE上，并用Rab5、EEA1、GAPDH和TOM20抗体进行免疫标记。显示EEA1的长曝光螺栓（右侧面板）。(B类)Rab5的密度定量(A类). 带强度计算为M组分中Rab5与TOM20之间的归一化比率，以及C组分中Rab5与GAPDH之间的归一化比率。折叠更改在y轴上绘制。误差条表示三个独立实验的SEM。(C类)BAC GFP-Rab5 HeLa细胞与250µM H一起孵育2O（运行）2 在37°C持续2小时。细胞固定并用EEA1抗体进行免疫染色。在GFP-Rab5和EEA1之间进行Colocalization分析。(D类)HeLa细胞接种在384孔板中，并用PBS（对照）或250μM H预处理2O（运行）2然后用Alexa-647 Tfn（10μg/ml）对细胞进行脉冲处理5分钟，用PBS洗涤，固定，并用DAPI（核）和CellMask Blue（细胞质）染料染色。图像由Yogokawa共焦显微镜采集。比例尺，10μm。(E类)量化每个细胞的细胞质荧光强度，n个 = 50. p值基于双尾t检验。
图7。
图7.Rab5在H期间调节细胞色素c的释放2O（运行）2-诱导应力。
(A类)100 nM Mito-Red染色的BAC-GFP-Rab5细胞在250μM H治疗前（0分钟）和治疗后（60分钟）的活细胞成像2O（运行）2温度为37°C。插图显示，箭头表示GFP-Rab5招募到MOMP活动（右侧面板）。比例尺，10μm。(B类)用250μM H处理过表达GFP或GFP-Rab5的HeLa细胞2O（运行）2在37°C下放置1至4小时。从细胞溶质组分中获取蛋白质样品，并对细胞色素C和微管蛋白进行免疫印迹（作为负载控制）。(C类)细胞色素c释放的密度定量(B类). 数据来自三个独立的实验。Y轴对应于细胞色素c与微管蛋白负荷控制的标准化比值强度。p值基于双尾t检验。
图8。
图8。。H（H）2O（运行）2-诱发的Rab5向线粒体的易位是可逆的。
HeLa细胞接种在24孔板中(A类)或在玻璃盖玻片上(B类)和过夜培养后，用250µM或500µM H处理2O（运行）2 在37°C培养0、6、12、24小时，或在12小时后用新鲜培养基替换，然后再培养12小时。(A类)然后在SDS加载缓冲液中收集细胞，将蛋白裂解物加载到SDS-PAGE上，并用TOM20和GAPDH抗体进行免疫印迹。(B类)细胞固定并用Rab5和TOM20抗体进行免疫染色。将显示插入区域。比例尺，10μm。(C类)TOM20和Rab5的显色分析(B类),n个=50。p值基于双尾t检验。
图9。
图9线粒体应激下Rab5效应器的定位。
接种在网格培养皿上的BAC GFP-Rab5细胞用Mito-Red标记并像以前一样进行光照。激光治疗30分钟后固定细胞，并用抗ZFYVE20和EEA1抗体进行免疫染色(A类)，或APPL1和APPL2(B类). 将显示插入区域。比例尺，10μm。(C类)未经处理和激光处理的细胞中的Colocalization分析(A类)和(B类),n个 = 3. p值基于双尾t检验。(D类)在用PBS（对照）或250μM H处理的HeLa细胞中进行亚细胞分级2O（运行）2在37°C下放置2小时。来自纯化线粒体（Mito）和细胞溶质的蛋白质样品(C类)将组分加载到SDS-PAGE上，并用针对Rab5、EEA1、Rabenosyn-5、APPL1、APPL2和TOM20的抗体进行免疫标记。
图9——图补充1。
图9：图补充1：内源性Rabenosyn-5、EEA1、APPL1和APPL2的定位。
BAC GFP-Rab5细胞接种在玻璃盖玻片上，固定，并用抗Rabenosyn-5抗体进行免疫染色(A类)、EEA1(B类)，应用程序1(C类)和APPL2(D类). 显示了插入区域。比例尺，10μm。
图9——图补充2。
图9-图增补2.GFP-2xFYVE的本地化高分辨率分光计激光诱导应力。
用GFP-2xFYVE转染HeLa细胞高分辨率分光计24小时，用100 nM Mito-Red标记，像以前一样进行光照，然后进行实时成像。在激光后（0分钟）和60分钟后立即采集图像。
图10。
图10线粒体应激下Rabex-5和Alsin的定位。
接种在网格培养皿上的BAC GFP-Rab5细胞用100 nM Mito-Red标记，并像以前一样进行光照。激光治疗30分钟后固定细胞，并用抗Rabex-5抗体进行免疫染色(A类)或阿尔辛(B类). 将显示插入区域。比例尺，10μm。(C类)未经处理和激光处理的细胞中的Colocalization分析(A类)和(B类),n个 = 3. p值基于双尾t检验。
图10——图补充1。
图10补充图1.Rabex-5和Alsin的内源性定位。
BAC GFP-Rab5细胞接种在玻璃盖玻片上，固定，并用针对Rabex-5的特异性抗体进行免疫染色(A类)或阿尔辛(C类). 将显示插入区域。比例尺，10μm。(B类)人类阿尔辛领域组织的示意图。标记了染色体凝聚1（RCC1）、B细胞淋巴瘤（Dbl）同源性（DH）和pleckstrin同源性（PH）、膜占位和识别连接（MORN）基序以及空泡蛋白排序9（VPS9）域的调控因子。注释了三个假定的全球环境基金领域。
图10——图补充2。
图10-图补充2。Alsin或Rab5过度表达阻断caspase-3/7激活。
(A类)瞬时表达空载体、Alsin或Rab5的HeLa细胞在500μM H的存在下培养2O（运行）2和5μM CellEvent胱天蛋白酶3/7绿色检测试剂在37°C下检测2小时。细胞核用DAPI（蓝色）染色。通过共焦显微镜获得图像。半胱氨酸蛋白酶激活的细胞显示绿色信号，而非激活的细胞（PBS对照）则无信号。阳性信号细胞的百分比在(B类),n个 = 50. 误差条代表SEM。比例尺，10μm。
图11。
图11：Rab5招募需要Alsin并调节细胞色素c的释放。
(A类)流程图描述了从诱导多能干细胞（iPSC）到神经原细胞（NPC）和成熟脊髓运动神经元（sMN）的不同阶段和时间（以天为单位）。显示了不同阶段使用的小分子和化合物并进行了彩色编码。(B类)WT和Alsin-/-用PBS（Ctrl）或100µM H挑战细胞2O（运行）2在37°C下1小时。固定细胞并用Rab5和TOM20抗体进行免疫染色。显示插图。比例尺，10μm。(C类)线粒体（Mito）和细胞溶质的亚细胞分馏(C类)WT和Alsin的馏分-/-iPSC-sMN受到PBS或100μM H的挑战2O（运行）2在37°C下放置1小时。将蛋白质样品加载到SDS-PAGE上，并用Rab5、微管蛋白和TOM20抗体进行免疫标记。(D类)细胞溶胶部分由WT和Alsin制备-/-100μM H挑战iPSC-sMN2O（运行）2在37°C下放置1小时。从三个独立的实验中收集细胞溶质细胞色素C的密度定量。Y轴对应于细胞色素c和微管蛋白的标准化比值强度。误差条代表SEM。p值基于双尾t检验。
图11-图补充1。
图11-图补遗1.CRISPR/Cas9 Alsin的验证-/-iPSC、NPC和iPSC-sMN中的细胞。
(A类)使用位于外显子3两侧和外显子3中的引物进行PCR反应的电泳结果。纯合缺失通过2.8 kb的缺失得到证实。(B类)WT KOLF和Alsin的蛋白裂解物-/-将iPSC加载到SDS-PAGE上，并用Alsin抗体进行免疫印迹。在~184 kDa处检测到一条带，但在阿尔辛不存在-/-，对应于全长阿尔辛。(C类)WT KOLF，阿尔辛-/-iPSC和神经祖细胞（NPC）分别用多能性标记Oct4和Lin28以及神经祖细胞标记Sox2和Pax6进行免疫染色。(D–E型)WT KOLF和阿尔辛-/-用运动神经元标记物如ChAT、HB9和ISL1、核染料DAPI和细胞骨架标记物MAP2对iPSC-sMN进行免疫染色。(F类)WT KOLF和阿尔辛-/-iPSC-sMN用抗Rab5和Alsin的抗体以及DAPI（核）和阳萎素（肌动蛋白）染色进行免疫染色。比例尺，10μm。
图12。
图12：描述氧化应激期间Rab5-Alsin线粒体作用的示意模型。
正常情况下，线粒体（Mito，红色）呈细长管状（左侧）。Rab5（绿色）定位于早期内胚体（EE）上，组装Rab5机械，用于内胚体成熟和膜运输。在稳定状态下，一些EE与线粒体发生短暂接触。在氧化应激（例如激光或化学诱导）期间，线粒体经历MOMP，并发生戏剧性的形态转变，形成圆形和肿胀结构（右）。凋亡因子细胞色素c从线粒体释放到胞质溶胶中与Rab5通过胞质中间体从EE到线粒体的重新定位事件有关，同时伴有EE线粒体MCS的增加。线粒体上Rab5的募集和激活依赖于Rab5 GEF Alsin（蓝色），这导致Rabenosyn-5（浅绿色）的选择性募集。线粒体上的这种信号级联是一个可逆过程，调节凋亡程序（例如细胞色素c释放和caspase激活），从而促进整体细胞存活。
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