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.2018年2月20日；9(3):298.
doi:10.1038/s41419-018-0360-0。

神经酰胺诱导的脑钾促进子痫前期线粒体分裂

乔纳森·奥斯曼 1 2, 乔尔西奥修道院 1 三, 莱昂纳多·埃尔米尼 1, 艾比·法雷尔 1 2, 安德烈亚·塔利亚费罗 1, 马丁·波斯特 2 4 5, 伊莎贝拉·卡尼吉亚 6 7 8 9
附属公司

神经酰胺诱导的BOK促进子痫前期患者线粒体分裂

乔纳森·奥斯曼等。 细胞死亡疾病. .

摘要

线粒体在细胞信号的作用下处于融合和分裂的恒定平衡。融合产生健康的线粒体，而裂变导致非功能性细胞器的去除。线粒体动力学的变化是几种人类疾病的典型特征。然而，线粒体动力学对先兆子痫（一种以胎盘细胞自噬和死亡为特征的妊娠高血压疾病）的影响尚不清楚。在此，我们发现先兆子痫胎盘的线粒体动态平衡倾向于分裂（DRP1表达/激活增加，OPA1表达减少）。先兆子痫胎盘线粒体分离物中DRP1（p-DRP1）磷酸化的增加和透射电子显微镜证实了PE胎盘细胞滋养层细胞中线粒体断裂的增加。与对照组相比，分裂增加伴随着子痫前期胎盘线粒体中神经酰胺（CER）的积聚。用CER 16:0处理人绒毛膜癌JEG3细胞和原代分离的细胞滋养层细胞可增强线粒体分裂。功能丧失和获得实验表明，通过CER增加表达的Bcl-2成员BOK正向调节p-DRP1/DRP1和MFN2的表达，并将线粒体分裂事件定位到ER/MAM隔室。我们还发现，BOK的BH3和跨膜结构域对BOK调节裂变至关重要。此外，我们发现全长PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）和Parkin在PE胎盘线粒体中升高，这意味着有丝分裂是降解CER/BOK诱导的子痫前期分裂产生的多余线粒体碎片的过程。总之，我们的研究揭示了一种新的CER/BOK诱导的线粒体分裂调控及其对子痫前期滋养层细胞自噬增强的功能后果。

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数字

图1
图1。子痫前期患者线粒体动力学的变化与神经酰胺的线粒体积累有关。
DRP1的代表性蛋白质印迹和相关密度测定(一，上部面板），MFF(一，中间面板）和OPA1(一，下面板）。DRP1 WB和密度测定法：PE，n个 = 30; PTC、，n个 = 22; 未成对学生的t吨-测试***P（P） < 0.001之间。MFF WB:聚乙烯，n个 = 18; PTC、，n个 = 9; 未成对学生的t吨-测试P（P） = 纳秒。OPA1 WB和密度测定：PE，n个 = 13; PTC，n个 = 10; 未成对学生的t吨-测试*P（P） < 0.05).b条从PE和PTC胎盘（PE，n个 = 4；PTC、，n个 = 4；未成对学生的t吨-测试**P（P） < 0.01).c（c）p-DRP1在PE与PTC胎盘（PE，n个 = 4；PTC、，n个 = 4).d日OMA-1在PE和PTC胎盘（PE，n个 = 8; PTC、，n个 = 7; 未成对学生的t吨-测试*P（P） < 0.05).e（电子）通过LC-MS/MS（PE，n个 = 4；PTC、，n个 = 4；未成对学生的t吨-测试*P（P） < 0.05). 所有数据均表示为平均值 ± SEM（平均值标准误差）
图2
图2。子痫前期与细胞滋养层细胞线粒体分裂形态有关。
一妊娠29至30周PE和PTC胎盘细胞滋养层细胞的典型TEM图像。（i） PTC中典型的线粒体形态由白色箭头确定（比例尺：500 nm）和（ii）PE中的线粒体裂变事件用白星表示（N，核；比例尺：500 纳米）。（iii/iv）PE和PTC中的线粒体用白色箭头表示（N，细胞核；比例尺：1 微米）。（v/vi）线粒体宽度用白色虚线表示（比例尺：100 纳米）。b条PE与PTC中每个细胞的线粒体数量（PE胎盘，n个 = 8个（167个线粒体）；胎盘PTC，n个 = 7（63个线粒体）；未成对学生的t吨-测试*P（P） < 0.05），以及c（c）PE与PTC的线粒体宽度（PE，n个 = 8; PTC、，n个 = 7份单独的组织样本；未成对学生的t吨-测试**P（P） < 0.01). 数据表示为平均值 ± SEM（平均值标准误差）
图3
图3。CER刺激DRP1的表达和激活，同时降低JEG3细胞中的OPA1水平。
一用CER 16:0或EtOH载体（V）处理的JEG3细胞中DRP1、p-DRP1，MFF和MiD49的典型western印迹和相关密度测定(n个 = 10个单独的实验，一式两份；未成对学生的t吨-测试*P（P） < 0.05, ***P（P） < 0.001). (b条)CER 16:0或ETOH载体处理的JEG3细胞中OPA1的典型western blot(n个 = 3个单独实验，一式两份；未成对学生的t吨-测试*P（P） < 0.05). 数据表示为平均值 ± SEM（平均值的标准误差）。c（c）用CER 16:0或EtOH载体（V）处理并用Mitotracker®标记的JEG3细胞中p-DRP1的IF分析。p-DRP1（绿色）、Mitotracker®（红色）和核DAPI（蓝色）。d日2-OE（25 µM）或控制车辆(n个 = 3个单独的实验；未成对学生的t吨-测试*P（P） < 0.05).e（电子）注射ceranib-2（20 mg/kg）或DMSO载体（DMSO，n个 = 8; Ceranib-2，n个 = 9; *P（P） < 0.05)
图4
图4。神经酰胺在原代分离的滋养层细胞中诱导线粒体分裂。
一用CER 16:0或EtOH载体处理的原始分离细胞滋养层细胞中DRP1、p-DRP1和OPA1的典型western blots和相关密度测定（V）(n个 = 3种不同的原代细胞隔离*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001; 数据表示为平均值 ± SEM：平均值的标准误差）。b条暴露于CER 16:0或EtOH载体（V）后，对原始分离细胞滋养层细胞中的p-DRP1（绿色）和MFF（红色）进行IF分析。细胞核用DAPI（蓝色）染色。c（c）CER 16:0或ETOH载体处理的足月胎盘原始分离细胞滋养层细胞的代表性透射电镜(n个 = 5种不同的原电池隔离）。（i/iii）载体处理的细胞中的线粒体形态通过白色箭头进行鉴定（比例尺：（i）500 纳米；（iii）2 微米）；（ii/iv）CER 16:0处理细胞中的线粒体裂变事件和碎片由白星（比例尺：ii）500确定 纳米；（iv）2 微米）
图5
图5。CER增加BOK诱导的DRP1表达，导致线粒体断裂。
一用CER 16:0或EtOH载体（V）处理的JEG3细胞中BOK（绿色）的IF分析，并用Mitotracker®（红色）和DAPI（蓝色）染色。b条稳定转染GFP-BOK并用多西环素（Dox 0、1.25或2.5）诱导的HEK-293细胞中BOK、p-DRP1和DRP1的典型western blot和相关密度测定 纳克/毫升，n个 = 3个单独的实验，一式两份；单向方差分析，Tukey的后验*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01).c（c）稳定转染GFP-BOK和2.5诱导HEK-293细胞的典型TEM图像 ng/ml Dox（右面板）或用dH处理2O（控制：左面板）。健康的线粒体形态由白色箭头表示，而线粒体裂变事件由白色恒星表示（比例尺：500 纳米；Dox 0（车辆控制）和2.5 纳克/毫升，n个 = 3个单独的实验）。d日瞬时转染HEK-293细胞后BOK、p-DRP1、DRP1和MFF表达的典型western blots和密度分析BOK（确定）siRNA或加扰序列（SS）；n个 = 3个单独的实验一式两份；未成对学生的t吨-测试(*P（P） < 0.05）
图6
图6。BH3和TMD结构域负责BOK诱导的线粒体分裂。
)暴露于CER 16:0或EtOH载体（V）后，用含有空载体（EV）、WT BOK和BOK-∆BH3的质粒转染的HEK-293细胞中DPR1和BOK的典型蛋白质印迹。(一，下面板）在暴露于CER 16:0或V后，对转染EV、WT BOK和BOK-∆BH3的HEK-293细胞中DRP1的密度分析(n个 = 4个不同的实验；单向方差分析，Tukey的后验*P（P） < 0.05).b条稳定转染诱导型GFP-BOK-∆TMD的HEK-293细胞中DRP1和BOK的代表性western blot，结合DRP1的相关密度测定（Dox 0（载体）和2.5 纳克/毫升，n个 = 3个单独的实验，一式两份***P（P） < 0.001)
图7
图7。神经酰胺在线粒体相关内质网膜上触发BOK与p-DRP1和MFN2以及VDAC1到IP3R的关联。
一稳定转染GFP-BOK并用Dox（Dox:0（dH2O车辆），1.25和2.5 纳克/毫升，n个 = 4个单独的实验，一式两份；单向方差分析，Tukey的后验*P（P） < 0.01).b条用CER 16:0或EtOH载体处理的原代分离细胞滋养层细胞染色：（i/ii）BOK（绿色）、钙网蛋白（红色）和核DAPI（蓝色）(n个 = 3个单独的实验）；（iii/iv）p-DRP1（绿色）、钙网蛋白（红色）和核DAPI（蓝色）(n个 = 3个单独的实验）；（v/vi）BOK（绿色）、MFN2（红色）和核DAPI（蓝色）(n个 = 3个单独的实验）；和（vii/viii）p-DRP1（绿色）、MFN2（红色）和核DAPI（蓝色）(n个 = 3个单独的实验）。c（c）暴露于CER 16:0（20 μM）和2-油酰基乙醇胺（2-OE；25 μM）用于6 h.没有阳性和阴性PLA探针的反应被用作阴性对照
图8
图8。在子痫前期，线粒体分裂有助于去除多余的线粒体片段。
(一（左面板）29周时采集的PTC和PE胎盘细胞滋养层细胞的典型TEM图像。线粒体接近ER（MAM）用白色箭头表示，线粒体裂变事件用白色恒星表示（比例尺：500 纳米；n个 = 8个单独的PE胎盘）。(一，右图）PE与PTC中线粒体与ER连接的百分比（PE胎盘，n个 = 8; 胎盘PTC，n个 = 7; 未成对学生的t吨-测试*P（P） < 0.05).b条从PE和PTC胎盘分离的ER中MFN2和钙网蛋白的代表性western blot，n个 = 3个单独的样品）。c（c）PTC和PE胎盘线粒体中ASAH2（归一化为TOM20）的WB和相关密度测定。d日典型TEM显示PE胎盘细胞滋养层细胞的有丝分裂（白色箭头）（比例尺：500 纳米，n个 = 8个单独的PE胎盘）。e（电子）PE和PTC线粒体分离物中PINK1和Parkin的Western blot和相关密度测定。使用PINK1印迹密度测定法计算全长PINK的比率63kDa（千帕）劈开PINK153千Da（PE和PTC，n个 = 4个独立的胎盘*P（P） < 0.05)
图9
图9。PE中线粒体分裂增加机制的假定模型。
PE中线粒体分裂增加机制的假定模型。PE妊娠线粒体中神经酰胺升高激活DRP1并增加其在OMM向MFF的募集。p-DRP1寡聚并完成线粒体分裂过程。神经酰胺引发向OMM招募BOK；反过来，有助于增强p-DRP1表达，并通过诱导MFN2表达增加MAM系留。通过PINK1/Parkin依赖性有丝分裂降解线粒体片段
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