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.2018年3月28日；38(13):3177-3189.
doi:10.1523/JNEUROSCI.3368-17.2018。 Epub 2018年2月16日。

耳蜗毛细胞溶酶体粘蛋白3和1的编码降低外毛细胞寿命并加速与年龄相关的听力损失

提拉瓦特·维瓦特帕尼特 1 2, 娜塔莉·雷米斯 1 2, 艾沙·艾哈迈德 三, 周英杰 三, 约翰·克兰西 2, 玛丽·安·切坦 三 4, 杰米·加西亚·阿尼奥弗罗斯 5 2 4 6
附属机构

耳蜗毛细胞溶酶体粘蛋白3和1的编码降低外毛细胞寿命并加速与年龄相关的听力损失

提拉瓦特·维瓦特帕尼特等。 神经科学. .

摘要

后天性听力损失是与人类老化相关的主要神经退行性疾病。尽管已知几个基因的突变会导致新生儿先天性耳聋，但很少有基因与年龄相关的听力损失（ARHL）有关，可能是因为其原因可能是多基因的。在这里，我们培育了缺乏溶酶体钙通道粘蛋白3和1的小鼠，发现雄性和雌性小鼠都患有多基因形式的听力损失。尽管粘蛋白1在所有细胞中普遍表达，但粘蛋白3在耳蜗细胞、毛细胞（HCs）和血管纹边缘细胞的一小部分中表达，其他细胞类型很少。小鼠在1个月大的时候就出现了听力损失，它们缺乏粘蛋白3和1，但不是单独一种。听力损伤的严重程度从高频发展到低频，并且随着年龄的增长而增加。这些小鼠ARHL的早期发病伴随着外HC（OHC）的丢失。HCs中有条件地缺乏粘蛋白的成年小鼠表现出类似的听觉表型，从而揭示了OHC丢失的原因是HCs中的粘蛋白协同作用，而不是血管纹中的。此外，我们观察到缺少粘蛋白的OHC包含聚集在细胞顶端区域的异常增大的溶酶体，而其他细胞器则正常。我们还证明，OHC中这些异常溶酶体通过溶酶体膜的通透性丧失了膜的完整性，这是细胞毒性的已知原因，解释了OHC死亡的原因和方式，导致早期ARHL。重要性声明老年性耳聋（ARHL）是哺乳动物衰老的常见特征。虽然许多基因已被确定可导致人类和小鼠出生时的耳聋，但只有少数已知与进展性ARHL相关，ARHL是最常见的耳聋形式。我们发现，由于听觉外毛细胞变性，缺乏粘脂蛋白3和1这两种溶酶体通道的小鼠会加速ARHL，而听觉外毛细胞变性是人类听力损失和神经退行性疾病的最常见原因。缺乏粘蛋白的溶酶体经历细胞器膜渗透，并随着年龄的增长促进细胞毒性，揭示了外毛细胞退化和ARHL的新机制。这些结果强调了溶酶体在毛细胞存活和听力维持中的重要性。

关键词：ARHL；TRPML；听力；溶酶体；粘蛋白；老年性聋。

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数字

图1。
图1。
HCs中粘蛋白3和1的共同缺乏（但不是单独存在）会导致年龄相关性听力损失从高频发展到低频。A–H，使用ABR测定27和12 kHz时的听力阈值(A类,C类,E类,G公司)和DPOAE(B类,D类,F类,H（H）)成年（～P60–P120）和幼年（～P30）小鼠。A类,B类，缺乏粘脂蛋白3和1（DKO），但不是单独缺乏（ML1KO或ML3KO）的成年小鼠的ABR升高(A类)和DPOAE(B类)与WT小鼠相比，阈值为27 kHz。幼年DKO小鼠（～P30）在27 kHz时，ABR和DPOAE的阈值偏移都较小。C类,D类，ABR显示成年DKO小鼠在12 kHz时有轻度听力损失(C类)和DPOAE(D类)阈值偏移。在12 kHz时，幼年DKO小鼠具有中等ABR和DPOAE阈值偏移。E–H（E–H），仅在HCs中有条件地缺乏粘蛋白3和1的小鼠（cDKO）的听力测试表明，成年cDKO小鼠（～P120）的听力阈值在27(E类,F类)和12(G公司,H（H）)千赫。来自成年DKO小鼠的年龄匹配（P120）数据(A–D)已选择并重新标记(E–H（E–H）)统计比较ABR(E类,G公司)和DPOAE(F类,H（H）)所有细胞中缺乏粘蛋白的小鼠与仅HCs中缺乏粘糖蛋白的小鼠之间的阈值*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001; ****第页< 0.0001.
图2。
图2。
粘脂蛋白3定位于成人和新生儿耳蜗的绒毛膜和血管纹。成人（～P120）粘蛋白3羧基末端（TRPML3-CT）的免疫组织化学(A–D)和新生儿（第11页）(E–H（E–H）)耳蜗。A类，TRPML3-CT标记IHC和OHC以及血管纹细胞中的小泡(B类)WT耳蜗。C类,D类在ML3KO组织中，在两个HC的背景信号上方均未检测到TRPML3-CT免疫反应(C类)或血管纹(D类).E类,F类，新生儿Trpml3号机组前/后HCs表达粘蛋白3的模式与成人HCs相似；然而，P11 OHC和IHC的TRPML3-CT免疫反应水平是可比较的(E类). 粘蛋白3在P11血管纹中分布更广(F类).G公司,H（H），中未检测到TRPML3-CT免疫反应全球金融机构Cre公司/+;Trpml3号机组前/后HCs公司(G公司)虽然它的信号在血管纹中被检测到(H（H）). 比例尺：A类,C类,E类,G公司，10微米；B类,D类,F类,H（H），20微米。为了清楚起见，在顶部面板中概述了HC核和条纹边界。SM、Scala媒体。
图3。
图3。
OHC有一个解剖缺陷，但来自耳蜗的血管纹没有缺失粘蛋白3和1。A类血管纹中钾通道KCNQ1的免疫反应性表明，与WT、ML1KO和ML3KO动物相比，DKO耳蜗中钾通道没有定位错误。SM、Scala媒体。B类，纹厚度的量化表明DKO耳蜗中没有纹变性。C类,D类，肌动蛋白标记显示OHC(C类)，但不是IHC(D类)来自DKO的耳蜗大于对照耳蜗。E类,F类中弯HC角质板下方测量的HC顶面面积的量化证实了DKO OHC比对照组大。样本来自4到4.5个月大的动物。比例尺：A类，20微米；C类,D类，5微米****第页≤ 0.0001.
图4。
图4。
在缺乏粘脂蛋白3和1的动物中，与年龄相关的听力损失伴随着OHC死亡。A–E，肌动蛋白标记显示成年耳蜗的整装表面制备的HCs（～P120）。使用鼠标频率图（Müller等人，2005）计算了在12和27 kHz时传递声音的耳蜗位置。WT中12和27 kHz位置没有HC损失(A类)，ML1KO(B类)和ML3KO(C类)耳蜗。然而，在DKO中可以观察到OHC损失(D类)和cDKO(E类)耳蜗（星号）。在27 kHz位置，OHC损失的程度更严重。在两个位置均未观察到IHC损失。F类，细胞耳蜗电图显示所有基因型耳蜗螺旋线上的OHC和IHC损失百分比(A–E). *第页=0.014**第页= 0.009. ***第页= 0.0008. ****第页≤ 0.0001. 箭头表示对应于12和27 kHz的位置。比例尺，10μm。
图5。
图5。
缺乏粘蛋白3和1的OHC具有病理性放大的溶酶体。A类LAMP1（一种溶酶体膜蛋白）在成人（～P120）OHC中的免疫反应性揭示了DKO OHC中溶酶体的顶端堆积，但在WT、ML1KO和ML3KO控制的耳蜗中没有。B类超分辨结构光照显微镜显示，DKO OHC（而非对照组）具有LAMP1免疫反应性显示的溶酶体增大。B类，图像为来自第2行的OHC。C类，全细胞LAMP1荧光总量的量化A类显示DKO OHC中LAMP1显著增加，但在对照耳蜗中没有。D类，LAMP1全细胞强度值用于C类根据耳蜗位置（顶部、顶部/中间和中间）分别重新标记。我们观察到每个基因型的耳蜗匝间OHC LAMP1强度没有差异。E类，LAMP1强度值用于C类根据与细胞核的百分比距离，将OHC的顶基轴分为三段进行重新填塞。F类通过从共焦显微镜和结构光照显微镜的图像中测量LAMP1囊泡直径，我们发现DKO OHC的溶酶体直径比对照OHC的直径大约2.18倍。G公司，LAMP1囊泡直径在所有基因型中的频率分布图。比例尺：A类，5微米；B类，2μm*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001; ****第页≤ 0.0001.
图6。
图6。
缺乏粘蛋白3和1的OHC中溶酶体扩大不会导致受损细胞器溶酶体降解缺陷。A–C、使用不同细胞器标记物的WT、ML1KO、ML3KO和DKO成年（～P120）动物的整体耳蜗：过氧化物酶体（PMP70，A类)线粒体（COXIV，B类)和自噬体（LC3，C类). 过氧化物酶体的分布和数量没有明显缺陷(A类)，线粒体(B类)和自噬体(C类). 代表性图像由8个共焦光学截面投影重建而成，投影范围为0.88μm，位于角质板下方。D类,E类PMP70免疫反应显示，来自DKO OHC的每个OHC的过氧化物酶体数量和过氧化物酶体体积与来自对照组的相似。F类，在DKO和对照OHC之间，COXIV的全细胞荧光没有差异。G公司,H（H），DKO OHC的每个OHC的自噬体数量和自噬体体积（由LC3免疫反应性指示）与对照相似。比例尺，5μm。
图7。
图7。
缺乏粘蛋白3和1的OHC表现出溶酶体膜渗透性。A–Dgalectin 3是一种膜不渗透的细胞溶质凝集素，与腔溶酶体糖萼具有高亲和力（Aits等人，2015），与LAMP1的免疫反应性表明，DKO OHC中的溶酶体膜被渗透。半乳糖凝集素3在WT中是细胞溶质(A类)，ML1KO(B类)和ML3KO(C类)OHCs，其表达水平不同。D类相反，半乳糖凝集素3免疫反应性具有与DKO OHCs中的LAMP1信号相关的囊泡模式。E类超分辨率结构光照显微镜显示半乳糖凝集素3定位于溶酶体腔。F–I型组织蛋白酶D和LAMP1的免疫反应性表明，在溶酶体通透性后，DKO溶酶体含有极低水平的组织蛋白酶D.组织蛋白酶D具有与WT溶酶体强烈相关的囊泡表达模式(F类)，ML1KO(G公司)和ML3KO(H（H）)职业健康保险。我相反，在DKO溶酶体中组织蛋白酶D水平较低或检测不到。样本来自成年（～P120）动物。比例尺：A–D,F–I型，5微米；E类，2微米。
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