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.2018年2月15日；9(3):270.
doi:10.1038/s41419-018-0324-4。

肉桂酸钙介导的CaMKKβ-LKB1-AMPK通路激活通过调节细胞凋亡和自噬减轻db/db小鼠的糖尿病肾病

Ji Hee Lim先生 1 2, Hyung Wook Kim（韩国） 3, Min Young Kim女士 1 2, Tae Woo Kim先生 4, 恩尼姆·金 1, Yaeni Kim先生 1, 钟成镇 1, 年轻的Soo Kim 1, Bum Soon Choi先生 1, 金永秀 1, 尹世昌 1, 金惠元（Hye Won Kim） 5, Cheol Whee公园 6 7
附属公司

肉桂酸钙介导的CaMKKβ-LKB1-AMPK通路激活通过调节细胞凋亡和自噬减轻db/db小鼠的糖尿病肾病

Ji Hee Lim先生等。 细胞死亡病. .

摘要

细胞凋亡和自噬是维持组织稳态的协调调节的生物过程。AMP-activated protein kinase（AMPK）是一种代谢传感器，用于协调细胞存活和包括肾脏在内的各种器官的功能。我们研究了cinacalcet对高糖处理的人肾小球内皮细胞（HGEC）、小鼠足细胞和C57BLKS/J-db/db小鼠的肾脏保护作用。在培养的HGEC和足细胞中，cinacalcet降低了氧化应激和细胞凋亡，并增加了细胞内Ca增加导致的自噬2+钙的浓度和磷酸化2+/钙调素依赖性蛋白激酶激酶β（CaMKKβ）-肝激酶B1（LKB1）-AMPK及其下游信号，包括内皮型一氧化氮合酶（eNOS）磷酸化、超氧化物歧化酶和B细胞白血病/淋巴瘤2/BCL-2相关X蛋白表达增加。有趣的是，细胞内螯合剂BAPTA-AM逆转了肉桂酸诱导的CaMKKβ升高和LKB1磷酸化。Cinacalcet在不影响血糖或钙的情况下减少蛋白尿2+与钙敏感受体表达增加和CaMKKβ-LKB1磷酸化有关。随后激活AMPK，随后激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化物-1α和磷酸化-Ser1177eNOS-一氧化氮，导致细胞凋亡和氧化应激减少以及自噬增加。我们的结果表明，cinacalcet增加细胞内钙2+随后在GEC和肾脏足细胞中激活CaMKKβ-LKB1-AMPK信号，通过调节细胞凋亡和自噬为2型糖尿病肾病提供了一种新的治疗手段。

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数字

图1
图1。[Ca的变化2+]i和接触cinacalcet和高糖培养基的HGEC的细胞内信号传导。
一[Ca的变化2+]i HGEC暴露于cinacalcet和高糖培养基。为了确定添加cinacalcet是否可以调节[Ca2+]i在HGEC中，使用不同浓度（15，100）刺激FURA-2AM负载的HGEC 低葡萄糖（LG；5 mmol/l D-葡萄糖）或高糖（HG；30 mmol/l D-葡萄糖）培养基。曲线下面积（AUC）是从归一化数据基线（注射点）到荧光水平以及注射时间点之间（0 最小值）和10 最小值。测量曲线的峰值作为曲线的最高值。[Ca的峰值振幅和AUC2+]在LG和HG培养基中，cinacalcet以剂量依赖的方式显著增加了i。在图1a中，箭头表示cinacalcet的给药（15和100 nM）(n个===========================================================================每个实验中有6个独立实验）*第页 < 0.05; **第页 < 与LG和HG相比为0.01。b条接触cinacalcet和高糖培养基的HGEC细胞内信号的变化。代表性免疫荧光(n个===========================================================================每个实验6个独立实验）和western blot分析(n个===========================================================================每个实验中有4个独立的实验）428LKB1和磷酸化-Thr172低血糖（LG；5）中培养的HGEC中的AMPK mmol/l D-葡萄糖）或高糖（HG；30 mmol/l D-葡萄糖）条件下使用或不使用cinacalcet治疗（15 nM），并显示结果的定量分析*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01和#P（P） < 0.001与其他组相比
图2
图2
cinacalcet对低血糖（LG；5）培养的HGEC中AMPK-eNOS氧化应激和凋亡的细胞内信号传导的影响 mmol/l D-葡萄糖）或高糖（HG；30 mmol/l D-葡萄糖）条件下使用或不使用cinacalcet治疗（1、5、15 纳米）(a–d). 总AMPK、磷光体-Thr的代表性Western blot分析和定量分析172AMPK、总eNOS、磷酸化-Ser1177电子NOS(一, *P（P） < 0.05和**P（P） < 与LG控制相比为0.01），SOD1和SOD2(b条, *P（P） < 与其他组相比，0.05），二氢乙硫铵表达（作为氧化应激标记物；c（c）, *P（P） < 0.05和#P（P） < 0.001与其他组相比）、Bcl-2、Bax和TUNEL阳性HGEC(e（电子）, *P（P） < 0.05和**P（P） < 与其他组相比为0.01），显示了培养的HGEC中的β-肌动蛋白水平及其对结果的定量分析(n个===========================================================================每个实验4个独立实验）。d日BAPTA-AM（25 μM）对在低血糖或高糖（HG；30 mmol/l D-葡萄糖），有或没有cinacalcet治疗（15 nM）。CaMKKβ、磷酸-LKB1和总LKB1的代表性蛋白质印迹分析和定量分析(n个===========================================================================每个实验4个独立实验）*P（P） < 0.05和**P（P） < 与LG控制相比为0.01。（f）在接触cinacalcet和高糖培养基的HGEC中，与自噬相关的细胞内信号的变化。对培养的HGEC中的beclin-1、LC3-II/LC3-I比率和β-actin水平进行了典型的Western blot分析和定量分析，并对结果进行了定量分析(n个===========================================================================每个实验4个独立实验）。显示了HGEC中LC3点的典型免疫荧光分析和结果的定量分析(n个===========================================================================每个实验中有6个独立实验）**P（P） < 与其他组相比0.01
图2
图2
cinacalcet对低血糖（LG；5）培养的HGEC中AMPK-eNOS氧化应激和凋亡的细胞内信号传导的影响 mmol/l D-葡萄糖）或高糖（HG；30 mmol/l D-葡萄糖）条件下使用或不使用cinacalcet治疗（1、5、15 纳米）(a–d). 总AMPK、磷光体-Thr的代表性Western blot分析和定量分析172AMPK、总eNOS、磷酸化Ser1177电子NOS(一, *P（P） < 0.05和**P（P） < 与LG控制相比为0.01），SOD1和SOD2(b条, *P（P） < 与其他组相比，0.05），二氢乙硫铵表达（作为氧化应激标记物；c（c）, *P（P） < 0.05和#P（P） < 0.001与其他组相比）、Bcl-2、Bax和TUNEL阳性HGEC(e（电子）, *P（P） < 0.05和**P（P） < 与其他组相比为0.01），显示了培养的HGEC中的β-肌动蛋白水平及其对结果的定量分析(n个===========================================================================每个实验4个独立实验）。d日BAPTA-AM（25 μM）对在低血糖或高糖（HG；30 mmol/l D-葡萄糖），有或没有cinacalcet治疗（15 nM）。CaMKKβ、磷酸-LKB1和总LKB1的代表性Western blot分析和定量分析(n个===========================================================================每个实验4个独立实验）*P（P） < 0.05和**P（P） < 与LG控制相比为0.01。（f）在接触cinacalcet和高糖培养基的HGEC中，与自噬相关的细胞内信号的变化。对培养的HGEC中的beclin-1、LC3-II/LC3-I比率和β-actin水平进行了典型的Western blot分析和定量分析，并对结果进行了定量分析(n个===========================================================================每个实验4个独立实验）。显示了HGEC中LC3点的典型免疫荧光分析和结果的定量分析(n个===========================================================================每个实验中有6个独立的实验）**P（P） < 与其他组相比0.01
图3
图3
CaMKKβ、LKB1、磷酸-AMPK、SIRT1和磷酸-Ser的免疫印迹1177在高糖环境下，经西那卡塞治疗后，AMPKα1 siRNA、AMPKγ2 siRNA或SIRT1 siRNA中的eNOS可击倒HGEC(一和b条). 培养的HGEC以最终浓度50转染 nM CaMKKβ和LKB1、α1和α2-AMPK、SIRT1 siRNAs通过转染试剂作用24小时，并用cinacalcet（15 nM）。CaMKKβ和磷酸化Ser的代表性蛋白质印迹分析428LKB1号机组(一)以及磷酸化-Thr172AMPK、总AMPK，SIRT1，磷酸化-Ser1177电子NOS(b条)β-肌动蛋白水平和结果的定量分析也显示出来(一和b条）(n个===========================================================================每个实验4个独立实验）*P（P） < 0.05, **P（P） < 与含HG的对照siRNA相比为0.01
图4
图4。[Ca的变化2+]接触cinacalcet和高糖培养基的足细胞的i和细胞内信号传导。
一[Ca的变化2+]i在接触cinacalcet和高糖培养基的足细胞中。为了确定添加cinacalcet是否可以调节[Ca2+]i在足细胞中，使用不同浓度（15，100）刺激加载了FURA-2AM的足细胞 低葡萄糖（LG；5 mmol/l D-葡萄糖）或高糖（HG；30 mmol/l D-葡萄糖）培养基。AUC是从归一化数据基线（注射点）到荧光水平以及注射时间点之间（0 最小值）和10 min.曲线的峰值被测量为曲线的最高值。[Ca的峰值振幅和AUC2+]在LG和HG培养基中，cinacalcet以剂量依赖的方式显著增加了i。在图4a中，箭头表示cinacalcet的给药（15和100 nM）(n个===========================================================================每个实验中有6个独立的实验）**P（P） < 与LG和HG相比为0.01*P（P） < 与LG相比0.05 + 15和HG + 15b条接触cinacalcet和高糖培养基的足细胞细胞内信号的变化。代表性免疫荧光(n个===========================================================================每个实验6个独立实验）和western blot分析(n个===========================================================================CaSR、CaMKKβ、磷光体-Ser的每个实验中有4个独立实验428LKB1和磷酸化-Thr172低糖培养足细胞中的AMPK（LG；5 mmol/l D-葡萄糖）或高葡萄糖（HG；30 mmol/l D-葡萄糖）条件下使用或不使用cinacalcet治疗（15 nM），并显示结果的定量分析(n个===========================================================================每个实验中有6个独立实验）*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01和#P（P） < 与其他组相比0.001
图5
图5
cinacalcet对低糖培养的足细胞AMPK-eNOS细胞内信号传导、凋亡和氧化应激的影响（LG；5 mmol/l D-葡萄糖）或高糖（HG；30 mmol/l D-葡萄糖）条件下使用或不使用cinacalcet治疗（1 毫微米，5 纳米，15 纳米）(a–d). 总AMPK、磷光体-Thr的代表性Western blot分析和定量分析172AMPK、总eNOS、磷酸化-Ser1177电子NOS(一, *P（P） < 0.05和**P（P） < 与LG控制相比为0.01），SOD1和SOD2(b条, *P（P） < 0.05和**P（P） < 与LG对照组相比为0.01），二氢乙硫铵表达(c（c）, *P（P） < 0.05和#P（P） < 0.001与其他组相比）、Bcl-2、Bax和TUNEL阳性足细胞(e（电子）, *P（P） < 0.05和**P（P） < 与LG控制和#P（P） < 0.001与其他组相比），以及培养的足细胞中的β-肌动蛋白水平及其结果的定量分析(n个===========================================================================每个实验4个独立实验）。d日BAPTA-AM对低糖或高糖培养的足细胞（HG；30 mmol/l D-葡萄糖），有或没有西那卡司治疗（15 nM）。CaMKKβ、磷酸-LKB1和总LKB1的代表性Western blot分析和定量分析(n个===========================================================================每个实验4个独立实验）*P（P） < 0.05和**P（P） < 与LG控制相比为0.01。（f）接触cinacalcet和高糖培养基的足细胞中与自噬相关的细胞内信号的变化。显示了培养足细胞中beclin-1、LC3-II/LC3-I比率和β-actin水平的典型western blot分析和定量分析及其结果的定量分析(n个===========================================================================每个实验4个独立实验）。显示了足细胞中LC3点的代表性免疫荧光分析和结果的定量分析**P（P） < 0.01和#P（P） < 0.001与其他组相比(n个===========================================================================每个实验中有6个独立实验）
图5
图5
cinacalcet对低糖培养的足细胞AMPK-eNOS细胞内信号传导、凋亡和氧化应激的影响（LG；5 mmol/l D-葡萄糖）或高糖（HG；30 mmol/l D-葡萄糖）条件下使用或不使用cinacalcet治疗（1 纳米，5 纳米，15 纳米）(a–d). 总AMPK、磷光体-Thr的代表性Western blot分析和定量分析172AMPK、总eNOS、磷酸化-Ser1177电子NOS(一, *P（P） < 0.05和**P（P） < 与LG控制相比为0.01），SOD1和SOD2(b条, *P（P） < 0.05和**P（P） < 与LG对照组相比为0.01），二氢乙硫铵表达(c（c）, *P（P） < 0.05和#P（P） < 0.001与其他组相比）、Bcl-2、Bax和TUNEL阳性足细胞(e（电子）, *P（P） < 0.05和**P（P） < 与LG控制和#P（P） < 0.001与其他组相比），以及培养的足细胞中的β-肌动蛋白水平及其结果的定量分析(n个===========================================================================每个实验4个独立实验）。d日BAPTA-AM对低糖或高糖培养的足细胞（HG；30 mmol/l D-葡萄糖），有或没有cinacalcet治疗（15 nM）。CaMKKβ、磷酸-LKB1和总LKB1的代表性Western blot分析和定量分析(n个===========================================================================每个实验4个独立实验）*P（P） < 0.05和**P（P） < 与LG对照组相比为0.01。（f）接触cinacalcet和高糖培养基的足细胞中与自噬相关的细胞内信号的变化。显示了培养足细胞中beclin-1、LC3-II/LC3-I比率和β-actin水平的典型western blot分析和定量分析及其结果的定量分析(n个===========================================================================每个实验4个独立实验）。显示了足细胞中LC3点的代表性免疫荧光分析和结果的定量分析**P（P） < 0.01和#P（P） < 与其他组相比0.001(n个===========================================================================每个实验中有6个独立实验）
图6
图6。西那卡特对肾表型的影响分贝/米和分贝/分贝20周龄小鼠。
一肾小球系膜分数面积、TGF-β1和IV型胶原（Col IV）的表达以及肾小球皮质区F4/80阳性细胞浸润分贝/米和分贝/分贝小鼠，给予或不给予西那卡司治疗。用周期性酸-希夫试剂染色的代表性切片和TGF-β1、Col IV和F4/80阳性细胞（深棕色）的代表性免疫组织化学染色显示（原始放大，x400）。对系膜分数面积（%）、TGF-β1、COL IV和F4/80阳性细胞（fold）的结果进行定量分析(n个===========================================================================每组8人）。显示了TNF-α、IL-1β和β-actin表达的代表性Western blot分析及其结果的定量分析(n个===========================================================================每个实验4个独立实验）*P（P） < 0.05和**P（P） < 与相比0.01分贝/米续分贝/米 + cina组。b条cinacalcet对小鼠足细胞表型的影响分贝/米和分贝/分贝20周龄小鼠。肾小球基底膜增厚，足突宽度增宽，缝隔直径变窄分贝/分贝小鼠与分贝/米cinacalcet治疗后小鼠恢复正常(n个===========================================================================每组8人）#P（P） < 0.001与分贝/米续分贝/米 + cina组
图7
图7。CaSR和CaMKKβ-LKB1-AMPK-eNOS信号通路在大鼠肾内的表达分贝/米和分贝/分贝未使用或使用cinacalcet治疗的小鼠。
一和b条CaSR、CaMMKα/β、总LKB1、磷酸化Ser的代表性蛋白质印迹分析428LKB1、总AMPK、磷酸化-Thr172AMPK、PGC-1α、总eNOS、磷酸化-Ser1177eNOS和β-actin表达。对结果进行了定量分析(n个===========================================================================每个实验中3个）*P（P） < 0.05和**P（P） < 与其他组相比为0.01。c（c）SOD1和SOD2的肾内表达以及d日24小时尿8-羟基脱氧鸟苷（8-OH-dG）和异前列腺素浓度分贝/米和分贝/分贝未使用或使用cinacalcet治疗的小鼠。SOD1和SOD2的典型蛋白质印迹分析(n个===========================================================================每组3人）和24小时尿8-OH-dG和异前列腺素浓度的结果显示(n个===========================================================================每个实验中8个）*P（P） < 0.05和**P（P） < 与其他组比较0.01。e（电子）肾内Bcl-2/Bax比值和（f）肾小球中的TUNEL和WT-1阳性细胞分贝/米和分贝/分贝未使用或使用cinacalcet治疗的小鼠。促凋亡Bax、抗凋亡Bcl-2和β-actin表达的代表性Western blot分析(n个===========================================================================TUNEL阳性细胞（深棕色）的免疫组织化学染色（原始放大，x400）(n个===========================================================================每组8人）。对结果进行了定量分析*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01，以及#P（P） < 0.001与其他组相比。克肾内beclin 1和LC3-II/LC3-I比值以及小时LC3-II-PECAM-1，以及我肾小球中的LC3-II-肾上腺素阳性细胞分贝/米和分贝/分贝未使用或使用cinacalcet治疗的小鼠。显示了beclin-1、LC-3-I、LC3-II和β-actin表达的代表性Western blot分析。结果的定量分析如下所示(n个===========================================================================每组3人）*P（P） < 0.05和**P（P） < 与其他组相比0.01
图7
图7。CaSR和CaMKKβ-LKB1-AMPK-eNOS信号通路在大鼠肾内的表达分贝/米和分贝/分贝未使用或使用cinacalcet治疗的小鼠。
一和b条CaSR、CaMMKα/β、总LKB1、磷酸化-Ser的代表性Western blot分析428LKB1、总AMPK、磷酸化Thr172AMPK、PGC-1α、总eNOS、磷酸化-Ser1177eNOS和β-actin表达。对结果进行了定量分析(n个===========================================================================每个实验中3个）*P（P） < 0.05和**P（P） < 与其他组比较0.01。c（c）SOD1和SOD2的肾内表达以及d日24小时尿8-羟基脱氧鸟苷（8-OH-dG）和异前列腺素浓度分贝/米和分贝/分贝未使用或使用cinacalcet治疗的小鼠。SOD1和SOD2的典型蛋白质印迹分析(n个===========================================================================每组3人）和24小时尿8-OH-dG和异前列腺素浓度的结果显示(n个===========================================================================每个实验中8个）*P（P） < 0.05和**P（P） < 与其他组比较0.01。e（电子）肾内Bcl-2/Bax比值和（f）肾小球中的TUNEL和WT-1阳性细胞分贝/米和分贝/分贝未使用或使用cinacalcet治疗的小鼠。促凋亡Bax、抗凋亡Bcl-2和β-actin表达的代表性Western blot分析(n个===========================================================================每个实验中3个）和TUNEL阳性细胞（深棕色）的免疫组织化学染色（原始放大倍数，x400）(n个===========================================================================每组8人）。对结果进行了定量分析*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01，以及#P（P） < 0.001与其他组相比。克肾内beclin 1和LC3-II/LC3-I比值以及小时LC3-II-PECAM-1，以及我肾小球中的LC3-II-肾上腺素阳性细胞分贝/米和分贝/分贝未使用或使用cinacalcet治疗的小鼠。显示了beclin-1、LC-3-I、LC3-II和β-肌动蛋白表达的代表性蛋白质印迹分析。结果的定量分析如下所示(n个===========================================================================每组3人）*P（P） < 0.05和**P（P） < 与其他组相比0.01
图8
图8。西那卡司在糖尿病肾病中的作用以及西那卡司与2型糖尿病肾脏，特别是肾小球内皮细胞（GECs）和足细胞之间的相互作用。
AMPK公司AMP活化蛋白激酶，CaMKKβ钙2+/钙调素依赖性蛋白激酶β，CaSR公司钙感应受体，LKB1号机组肝激酶B1，[加利福尼亚州2+]我细胞内钙，前列腺素C-1α过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化子1-α
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