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.2018年2月14日；9(2):252.
doi:10.1038/s41419-018-0316-4。

自噬通量受损与创伤的严重程度和A的作用有关2安培创伤性脑损伤后脑细胞中的R

徐家曾 1, 李萍 1, 亚雷宁 1, 燕赵 1, 严鹏 1, 南阳 1, 赵子爱 1, 陈江凡 2, 袁国周 三
附属公司

自噬通量受损与创伤的严重程度和A的作用有关2安培创伤性脑损伤后脑细胞中的R

徐家曾等。 细胞死亡病. .

摘要

最近的研究表明，创伤性脑损伤（TBI）后，伤口周围脑细胞中自噬体的数量显著增加；然而，TBI是增强还是抑制自噬仍有争议。在我们的研究中，我们使用控制性皮质撞击系统建立轻度、中度和重度TBI模型。在轻度TBI模型中，自噬相关蛋白6（Beclin1）和自噬相关性蛋白12（ATG12）-自噬关联蛋白5（ATG5）结合物的水平增加，表明自噬的启动增强。此外，自噬底物固碳体1（SQSTM1）在同侧皮层的水平降低。这一结果以及在串联mRFP-GFP-LC3腺相关病毒（AAV）感染小鼠中观察到的结果表明，轻度TBI后自噬体清除率也增加。相反，中度和重度TBI后，自噬起始没有变化，并观察到自噬小体积聚。接下来，我们使用氯喹（CQ）人为地削弱轻度TBI模型受损皮层的自噬流量，发现创伤的严重程度明显加剧。此外，腺苷A的自噬流量和创伤严重程度显著改善2安培受体（A2安培R） 敲除（KO）小鼠遭受中度TBI。因此，A2安培R可能参与调节脑损伤后自噬流量的损伤。我们的研究结果表明，TBI后自噬是否增加与自噬流量是否受损有关，自噬通量的受损加剧了创伤的严重性。此外，A2安培R可能是减轻TBI后自噬流量受损的靶点。

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数字

图1
图1。轻度、中度和重度TBI后，受损皮层中的自噬体数量增加。
一Western blot分析损伤后1、3和7天从假手术和TBI小鼠获得的皮质组织裂解物中自噬相关蛋白LC3的水平。b条LC3-II水平如所示(一)量化并归一化为β-actin。所示数据表示为平均值 ± 扫描电镜，n个 = 5–6, *P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01.c（c）相对mRNA水平（qPCR）立方厘米在假手术和损伤的小鼠皮层。结果被归一化为β-肌动蛋白水平。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 3, *P（P） < 与假手术组相比为0.05。d日假手术和TBI小鼠大脑皮质切片的图像。切片用抗LC3抗体染色。比例尺 = 50 微米。电子LC3数据的集成光密度分析如所示(d日). 数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 5–6, *P（P） < 0.05时**P（P） < 与假手术组相比0.01
图2
图2。自噬的启动在轻度损伤时增加，但在中度和重度损伤时无明显变化。
一自噬相关蛋白Beclin1和ATG12–ATG5结合物水平的Western blot分析。b条中显示的Beclin1级别(一)定量并归一化为β-actin水平。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 5–6, *P（P） < 0.05.c（c）ATG12–ATG5缀合物水平如(一)定量并归一化为β-actin水平。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 5–6, *P（P） < 0.05.d日相对mRNA水平（qPCR）贝克林1在假手术和损伤的小鼠皮层。结果被归一化为β-肌动蛋白水平。所示数据表示为平均值 ± 扫描电镜，n个 = 3, **P（P） < 与假手术组相比，0.01。电子相对mRNA水平（qPCR）第5天在假手术和损伤的小鼠皮层。结果被标准化为β-肌动蛋白水平。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 3, *P（P） < 与假手术组相比0.05
图3
图3。中度和重度TBI后，皮质自噬流量受损，但轻度TBI除外。
一Western blot分析从假小鼠和TBI小鼠获得的皮质组织裂解物中的SQSTM1水平。b条中显示的SQSTM1级别(一)定量并归一化为β-actin水平。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 5–6, *P（P） < 0.05时**P（P） < 0.01.c（c）用SQSTM1抗体染色的假小鼠和TBI小鼠大脑皮层切片图像。比例尺 = 50 微米。d日SQSTM1数据的集成光密度分析如所示(c（c）). 数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 5–6, *P（P） < 0.05时**P（P） < 与假手术组相比为0.01。电子相对mRNA水平（qPCR）平方米1假小鼠和TBI小鼠。结果被归一化为β-肌动蛋白水平。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 3, *P（P） < 与假手术组相比，0.05。（f）假手术组和TBI组CQ处理小鼠同侧皮层LC3水平的Western blot分析。克LC3-II水平如所示（f）定量并归一化为β-actin水平。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 3, **P（P） < 0.01.小时从注射AAV-mRFP-GFP-LC3的假小鼠和TBI小鼠获得的大脑皮层切片图像。箭头表示存在红色斑点。比例尺 = 40 微米。我图中自溶体（红点/总点）和自噬体（黄点/总点状）百分比的量化(小时). 数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 3, *P（P） < 0.05时**P（P） < 与假手术组相比为0.01。在每次实验中，每只小鼠的细胞数量超过100个
图4
图4。CQ可降低轻度TBI后WT小鼠受损皮层的自噬流量，并加重脑损伤的预后。
一从接受假手术或轻度TBI（给予CQ或生理盐水）的WT小鼠大脑皮质切片中获得的凋亡细胞图像。显示假手术或轻度TBI后1天进行的TUNEL染色结果。箭头表示TUNEL阳性细胞。比例尺 = 50 微米。b条大脑皮层切片中TUNEL阳性细胞数量的量化如所示(一). 数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 5–6, **P（P） < 与对照组相比为0.01。c（c）WT小鼠假手术或轻度TBI后1天的脑含水量，然后给予CQ或生理盐水。结果是使用干湿法获得的。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 3, *P（P） < 与对照组相比为0.05。d日接受假手术或轻度TBI，然后给予CQ或生理盐水的WT小鼠的神经严重性评分。分别在假手术或轻度TBI后1、3和7天进行评分；所有受试者的中位数显示为中心线，方框表示第25–75个百分位，线条显示数据范围，n个 = 7, *P（P） < 0.05时**P（P） < 每个时间点与对照组相比0.01
图5
图5。A类2安培RKO或抑制可改善中度TBI后脑损伤的预后。
一从WT获得的大脑皮层切片中凋亡细胞的图像 + 待定，A2安培俄罗斯KO + TBI和WT + 待定 + ZM241385组在假手术或中度TBI后1天使用TUNEL染色。箭头表示TUNEL阳性细胞。比例尺 = 50 微米。b条大脑皮层切片中TUNEL阳性细胞数量的量化如所示(一). 数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 3, **P（P） < 与WT相比为0.01 + TBI组。c（c）WT中的脑含水量 + 待定，A2安培俄罗斯KO + TBI和WT + 待定 + ZM241385组在假手术或中度TBI后1天，采用干湿法测定结果。这些数据表示为平均值 ± 扫描电镜，n个 = 3, *P（P） < 与WT相比为0.05 + TBI组。d日WT的神经严重程度评分 + 待定，A2安培俄罗斯KO + TBI和WT + 待定 + ZM241385组在指定的时间点。分别在假手术或中度TBI后1、3和7天进行评分；所有受试者的中位数显示为中心线，方框表示第25–75百分位，线条显示数据范围，n个 = 7, *P（P） < 与WT相比为0.05 + 每个时间点的TBI组
图6
图6。A类2安培中度TBI后，R KO增加了自噬的启动，并减少了损伤皮层中自噬体的积累。
一Western blot分析自噬相关蛋白Beclin1、ATG12–ATG5结合物和LC3在从WT和KO小鼠的假和中度TBI组获得的皮质组织裂解物中的水平。b条Beclin1水平如所示(一)量化并归一化为β-actin水平。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 5–6, *P（P） < 0.05.c（c）ATG12–ATG5共轭能级如所示(一)量化并归一化为β-actin水平。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 5–6, *P（P） < 0.05.d日LC3-II水平如所示(一)量化并归一化为β-actin水平。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 5–6, **P（P） < 0.01.电子相对mRNA水平（qPCR）贝克林1假手术组和TBI组小鼠的β-肌动蛋白水平正常化。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 3, *P（P） < WT之间的比较为0.05 + TBI和KO + TBI组。（f）相对mRNA水平（qPCR）第5天假手术组和TBI组小鼠的β-肌动蛋白水平正常化。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 3, *P（P） < WT之间的比较为0.05 + TBI和KO + TBI组。克相对mRNA水平（qPCR）立方厘米在假手术和TBI小鼠中，β-肌动蛋白水平正常化。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 3, **P（P） < 0.01用于WT之间的比较 + TBI和KO + TBI组
图7
图7。A类2安培RKO改善了自噬体与溶酶体融合受损。
一Western blot分析WT和KO小鼠假TBI组和中度TBI组皮质组织裂解物中SQSTM1水平。b条SQSTM1水平如所示(一)量化并归一化为β-actin水平。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 5–6, **P（P） < 0.01.c（c）相对mRNA水平（qPCR）平方毫米1假手术组和TBI组小鼠的β-肌动蛋白水平正常化。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 三。d日Western blot分析假TBI组和中度TBI组CQ或盐处理KO小鼠同侧皮层LC3水平。电子LC3-II水平如所示(d日)量化并归一化为β-actin水平。数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 3, **P（P） < 0.01.（f）假TBI组和中度TBI组WT和KO小鼠受损皮层切片（×20）。切片用LC3和SQSTM1抗体染色。比例尺 = 10 微米。克量化大脑皮层切片中LC3单独阳性以及LC3和SQSTM1均阳性的细胞数量，如(（f）). 数据以平均值表示 ± 扫描电镜，n个 = 3, **P（P） < KO之间的比较为0.01 + TBI和WT + TBI组。在每次实验中，每只小鼠的细胞数量超过1000个
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