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.2018年3月1日；11（3）：dmm031815。
doi:10.1242/dmm.031815。

利用啮齿动物模型系统鉴定正常发育中代谢改变的早期指标

阿肖克·丹尼尔·普拉巴卡兰 1, Jimsheena Valiyakath Karakkat公司 1, 兰吉特·维贾扬 2, 吉沙茶馆 三, 马尔瓦·易卜拉欣 1, Suneesh Kaimala公司 1, 欧内斯特·阿德加特 1, 艾哈迈德·哈桑·阿尔·马尔佐奇 三 4, Suraiya Anjum Ansari公司 三, 埃里克·门萨-布朗 1, 亮椋鸟翡翠 5
附属公司

利用啮齿动物模型系统鉴定正常发育中代谢改变的早期指标

阿肖克·丹尼尔·普拉巴卡兰等。 Dis模型机械. .

摘要

尽管有人认为早期母亲发育环境、出生时胎儿大小和成年期疾病风险之间存在密切关系，但大多数研究都采用实验诱导的宫内生长受限作为模型，将其与晚期成人疾病联系起来。由于在正常生长和分化条件下，胚胎大小也会发生变化，因此，阐明这些变化的分子机制及其与后期成人疾病风险的相关性变得非常重要。幼鼠的出生体重根据子宫角的位置而变化。我们以出生体重为标志，利用形态学、生物化学、分子生物学和遗传技术，比较了两组幼鼠的出生体重，即较低出生体重（LBW，5%至25%）和平均出生体重（ABW，50%至75%）。我们的结果表明，胰岛素代谢、Pi3k/Akt和Pparγ信号传导以及调节生长和代谢的基因在这些组中存在显著差异。启动子甲基化InsII公司(2英寸)LBW幼崽的基因和DNA甲基转移酶1均增加。此外，包括Hdac1、Rb（Rb1）和E2f1在内的Dnmt1阻遏物复合物也在LBW幼鼠中上调。我们的结论是，调节细胞周期限制点的Dnmt1阻遏物复合体延缓了LBW幼崽细胞穿越细胞周期G1或G0期的速度，从而减缓了生长。Dnmt1介导的这种调节机制可能有助于小型幼犬的产生，并改变成年期的生理和病理。

关键词：平均出生体重；DNA甲基化；Dnmt1阻遏物复合物；表达式数组；出生体重较低；正常出生体重；Pi3k/Akt和Pparγ信号传导。

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数字

图1。
图1。
幼鼠的生长轨迹受出生体重的影响。（A） 出生时（第1天）、断奶后（第25天）和成年时（第145天）ABW和LBW幼崽的体重。（B） 出生时（第1天）、断奶后（第25天）和成年时（第145天）ABW和LBW幼崽的血糖。（C） 出生（第1天）、断奶（第25天）和成年（第145天）时ABW和LBW幼崽的血清胰岛素水平。（D） LBW幼崽（箭头）成虫中存在内脏脂肪，而ABW成虫中没有内脏脂肪*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，双尾未配对学生t吨-测试。
图2。
图2。
ABW和LBW幼崽的胰岛素、胰高血糖素和Pi3k/Akt途径基因的表达不同。（A） 1日龄ABW和LBW幼犬胰岛中分泌胰岛素的β细胞（绿色）和分泌胰高血糖素的α细胞（红色）的分布（比例尺：50 微米）。（B） 1日龄ABW和LBW幼鼠中胰岛素分泌β细胞（绿色）和胰高血糖素分泌α细胞（红色）的百分比。（C） qRT-PCR显示1日龄ABW和LBW幼崽胰腺中胰岛素和胰高血糖素mRNA表达的翻倍变化。18S用于使表达正常化。（D） 通过western blot分析确定1日龄ABW和LBW幼崽之间胰岛素和胰高血糖素表达水平的差异。Gapdh被用作加载控制。（E） 0，1时的葡萄糖耐量试验 h和2 6小时后 h禁食和服用2 1日龄ABW和LBW幼崽的葡萄糖体重（mg/kg）。（F） 0，1时的血清胰岛素浓度 h和2 6小时后 h禁食和服用2 用ELISA测定1日龄ABW和LBW幼崽的葡萄糖体重（mg/kg）。（G） Pi3k/Akt途径成分（Akt、Irs1、Glut4）的Western blot分析显示，LBW幼崽中Akt和Irs1的磷酸化水平以及Glut 4的膜分数降低。Gapdh被用作加载控制*P（P）<0.05, **P（P）<0.01，双尾未配对学生t吨-测试。
图3。
图3。
调节生长发育的基因在ABW和LBW幼崽之间的表达各不相同。（A） 来自ABW和LBW骨骼肌微阵列分析的热图显示ABW和LBW幼崽的基因发生了改变。（B） 在ABW和LBW幼崽之间，GO术语和基因数量及其途径受到不同的影响。
图4。
图4。
的表达式Pparg公司ABW和LBW幼崽的基因及其靶点不同。（A） qRT-PCR显示Rxra公司和阿迪波克LBW幼鼠与ABW幼鼠在第1天的比较。（B） Western blot分析显示LBW幼崽中Rxrα、Pparγ1和2以及AdipoQ的表达降低。（C） 大鼠脂联素基因启动子显示了本研究中测试的PPRE元件的位置（+1是转录起始点）。ABW（D）和LBW（E）幼崽脂联素启动子中Pparγ占位的（D，E）ChIP分析*P（P）<0.05, **P（P）<0.01，双尾未配对学生t吨-测试。
图5。
图5。
胰腺和骨骼肌中DNA甲基转移酶的表达，以及InsII公司胰腺中的启动子在ABW和LBW幼崽之间不同。（A） DNA甲基转移酶表达的qRT-PCR分析Dnmt1型,Dmnt3a公司和Dnmt3b型在第1天ABW和LBW幼鼠的胰腺中。（B） DNA甲基转移酶表达的Western blot分析显示，LBW幼崽胰腺中Dnmt1的表达增加，但Dnmt3a和Dnmtt3b的表达减少。（C） 老鼠InsII公司用Sequenom质量阵列系统分析的描述CPG位置的启动子。（D） Sequenom微阵列系统分析的ABW和LBW幼崽CpG的甲基化百分比。（E） qRT-PCR分析显示DNA甲基转移酶表达的差异Dnmt1型,Dnmt3a型和Dnmt3b型在ABW和LBW幼犬的骨骼肌中。的表达式Dnmt1型增加，表达Dnmt3a型减少，并且Dnmt3b型在两组中保持不变。（F） DNA甲基转移酶Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3 b表达的Western blot分析显示，LBW幼崽的Dnmt1增加，但Dnmt3a减少，但Dnm t3b的表达没有任何显著变化*P（P）<0.05, **P（P）<0.01，双尾未配对学生t吨-测试。
图6。
图6。
ABW和LBW幼崽的细胞周期调节不同。（A） 在第1天对ABW和LBW幼崽的Dnmt1阻遏物复合体成员E2f1、Rb和Hdac1的骨骼肌进行Western blot分析。Gapdh被用作加载控制。（B） 第1天，使用抗Dnmt1抗体对ABW和LBW幼崽的Dnmt1-阻遏物复合物进行Co-IP分析，并对复合物E2f1、Rb、Hdac1的成员进行western blot分析。Co-IP使用IgG作为对照；5%的总提取物用作输入。（C） 1日龄ABW和LBW幼鼠骨骼肌磷酸化Rb的Western blot分析（ser 608、ser 780和ser 795）。Gapdh被用作加载控制。（D） 在第1天使用ABW和LBW幼崽的骨骼肌进行细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白依赖性激酶Cdk4和Cdk6以及G1期细胞周期抑制剂P16和P21的Western blot分析。Gapdh被用作加载控制。
图7。
图7。
胚胎生长与母体环境协调和关联的可能机制。Dnmt1表达升高可能会增加基因启动子的甲基化，从而抑制正常生长所需的基因转录。此外，与Rb、E2f1和Hdac1形成Dnmt1抑制复合物可能会减缓细胞周期进展。这些过程可能共同作用，可能是LBW幼崽出生体重下降的原因。
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