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.2018年1月9:4:1。
doi:10.1038/s41421-017-0001-2。 2018年eCollection。

TUFT1与RABGAP1相互作用并调节mTORC1信号

川崎夏美 1, 卡祖诺布·伊索加亚 1, 新高丹 2, 高高雅森 2 三, 高野浩史 4, 姚良吉 4, 森下康之 1, 田口路娜 1, 森川正人 1 5, 卡尔·亨里克·赫尔丁 5 6, 野田忠雄 4, Shogo Ehata公司 1, Kohei Miyazono先生 1 5, 大佐小菊 1
附属公司

TUFT1与RABGAP1相互作用并调节mTORC1信号

川崎夏美等。 细胞发现. .

摘要

哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）通路通常在人类癌症中被激活。mTOR复合物1（mTORC1）信号的活性由细胞隔室的细胞内定位和囊泡运输支持，并由Rab GTPases调节。在这里，我们发现凝集素1（TUFT1）通过调节Rab GTPase调节过程参与mTORC1的激活。TUFT1促进肿瘤生长和转移。TUFT1的表达与肺癌、乳腺癌和胃癌的不良预后相关。从机制上讲，TUFT1与RABGAP1物理相互作用，从而调节细胞内溶酶体定位和囊泡运输，并促进mTORC1信号传导。此外TUFT1型预测对磷胺的敏感性，磷胺是一种改变脂筏组成的烷基磷脂。哌啶治疗改变了细胞隔室的定位和运输，以抑制mTORC1。我们的观察结果表明，TUFT1是mTORC1通路的关键调节因子，并表明它是一个有希望的治疗靶点或肿瘤进展的生物标志物。

PubMed免责声明

利益冲突声明

N.K.、K.I.、D.K.和K.M.已向日本专利局提交了与本作品相关的专利，申请号为2015-089220。其他作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。TUFT1是一种TGF-β诱导的癌症预后不良因子，调节肿瘤细胞形态、运动和增殖。
一Kaplan-Meier总生存率图分层TUFT1型使用KM-Plotter 2015版肺癌荟萃分析数据进行表达。在左边的面板中，显示了1926名患者的总体生存概率（按中位数划分）。在右侧面板中，I期肺腺癌患者接受了相同的分析。b条A549细胞的qRT-PCR分析以评估其反应性TUFT1型转化生长因子βmRNA表达（1 纳克/毫升） h.结果为平均值 ± 三个独立实验的s.e.m。c（c）转染有所示siRNAs的A549细胞经48 用TGF-β和荧光素结合的卵磷脂染色，以显示肌动蛋白应激纤维。图像是三个独立实验的代表。比例尺，20 微米。d日表达shRNAs和蛋白的A549细胞接种在带有胶原蛋白涂层孔的上腔中。括号中显示了外源表达的蛋白质。对通过膜迁移的细胞进行计数。代表性字段显示（左侧）。结果就是手段 ± 六个独立实验的s.e.m.（右）*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01***P（P） < 0.001.e（电子）A549细胞表达指示的shRNAs和蛋白质（5 × 104细胞）接种并培养48 h.用台盼蓝染色法测定A549细胞的活细胞数。括号中显示了外源表达的蛋白质。数据以平均值表示 ± 三个独立实验的s.d*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01.（f）共1×106表达shRNAs和蛋白的感染A549细胞被异种移植，并测量肿瘤体积。括号中显示了外源表达的蛋白质。结果显示了两个独立实验的组合数据。数据显示为平均值 ± s.e.m.公司。N个 = 每组9只（shTUFT1#2（GFP））或10只（其他）小鼠*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01.克通过注射MDA-231-D细胞（1×105细胞）表达指示的shRNAs。水平条表示每组的平均值。N个 = shNC组15只小鼠，N个 = shTUFT1#1组11只小鼠。以类似的结果重复实验，并显示了代表性图像（左图）。右面板显示了两个独立实验中每只小鼠的病灶数量的点图。ph/s：每秒光子计数。小时用指示的siRNAs转染A549细胞，并用或不用TGF-β处理48 h.通过免疫印迹法检测RhoA总量。结果代表了三个独立的实验。mRNA表达通过qRT-PCR（底部面板）定量。结果就是手段 ± 三个独立实验的s.e.m。我细胞培养方式为小时用免疫印迹法分析细胞裂解物。结果代表了两个独立的实验。细胞周期蛋白D1的mRNA表达(CCND1号机组)通过qRT-PCR（底部面板）定量。结果就是手段 ± 三个独立实验的s.e.m。
图2
图2。TUFT1控制mTORC1信号传导并影响溶酶体定位。
一mTORC1激活途径的示意图模型。b条用指示的siRNAs处理的A549细胞血清饥饿24小时 使用或不使用胰岛素刺激前h（10 µg/mL）进行3次 h.通过免疫印迹分析细胞裂解物。面板中的数值显示了磷酸化蛋白质的数量相对于蛋白质总量的比例，这是由ImageJ量化的。结果代表了三个独立的实验。c（c）野生型细胞裂解物（+/+）和塔夫脱1−/−MEF（每个基因型有2个克隆）处于饥饿状态（3 h） 或饥饿和重新刺激（10 min）添加营养素。细胞裂解物通过免疫印迹分析。磷酸化蛋白的量被定量为b条结果代表了两个独立的实验。d日转染有指示siRNA的A549细胞处于饥饿状态（3 h） 并重新刺激（10 min）和氨基酸（a.a.）。蛋白质与LAMP2（红色）和mTOR（绿色）抗体共免疫。合并的图形显示在底部面板中。图像是两个独立实验的代表。比例尺，10 微米。e（电子）如图所示，用siRNAs处理A549细胞。电子显微镜观察到电子致密的溶酶体样细胞器。下图显示了细胞核质心和溶酶体样细胞器之间平均距离的量化。图像是三个独立实验的代表。比例尺，2 微米**P（P） < 0.01.（f）转染有指示siRNAs的MKN45细胞处于饥饿状态（3 h） 或饥饿和重新刺激（10 min）和氨基酸（a.a.）。细胞裂解物通过免疫印迹分析。结果代表了两个独立的实验。磷酸化蛋白的相对量量化如下：b条注意，我们一直观察到氨基酸刺激会矛盾地降低MKN45细胞中S6K1的磷酸化，但不会降低S6的磷酸化度。透析血清成分的某些差异可能会影响S6K1的磷酸化。克MKN45细胞缺乏氨基酸3 h、 如图所示，用抗体对细胞进行染色。图像是两个独立实验的代表。比例尺，10 微米。小时A549细胞按d日使用mTOR和LAMP2抗体通过原位PLA检测mTOR与溶酶体的接近性。用DAPI对细胞核进行反染色。图像是三个独立实验的代表。比例尺，10 微米。
图3
图3。TUFT1下调导致细胞内小室定位和小泡运输的失调。
一饥饿的A549细胞（3 h） 并重新刺激（10 min）与营养物的抗体与EEA1（红色）和mTOR（绿色）的抗体共免疫染色。图像是两个独立实验的代表。比例尺，10 微米。b条转染有所示siRNAs的A549细胞的血清饥饿1 h，与Alexa594-共轭转铁蛋白（50 μg/mL） 在指定的时间段内为°C。代表性字段显示在左侧面板中。图像是两个独立实验的代表。比例尺，10 微米。在右侧面板中，显示了内部化的转铁蛋白荧光强度。结果就是手段 ± 两个独立实验的s.d。c（c）转染有所示siRNAs的A549细胞的血清饥饿1 h，用Alexa594-共轭转铁蛋白（50 μg/mL） 15°C 分钟。细胞固定在指定的时间点。代表性字段显示在左侧面板中。图像是两个独立实验的代表。比例尺，10 微米。在右侧面板中，使用ImageJ软件对细胞中的转铁蛋白数量进行量化。结果就是手段 ± 两个独立实验的s.d。
图4
图4。水泡运输的失调导致mTORC1失活。
一A549细胞处于饥饿状态（2 h） ，与纤维素D（50 µM）或EHNA（500 µM）用于1 h、 并重新刺激（10 min）添加营养素。收集细胞裂解物进行免疫印迹。磷酸化蛋白的相对量如图2b所示进行量化。结果代表了两个独立的实验。b条A549细胞按一用LAMP2（红色）和mTOR（绿色）抗体对细胞进行免疫染色。合并后的数字显示在底部面板中。图像是两个独立实验的代表。比例尺，10 微米。c（c）转染有指示siRNAs和Rab7a表达质粒的A549细胞处于饥饿状态（3 h） 并用营养物质重新刺激（10 最小值）。细胞裂解物通过免疫印迹分析。磷酸化蛋白的相对量被定量，如图2b所示。结果代表了两个独立的实验。CA，构成活性形式。
图5
图5。RABGAP1与TUFT1相互作用，调节溶酶体定位和mTORC1信号传导。
一用HA或TUFT1抗体对转染有所示siRNA的A549细胞的裂解液进行免疫沉淀。免疫沉淀物和3%输入提取物用所示抗体进行免疫印迹。结果代表了两个独立的实验。b条GST-10xHis-TUFT1、阴性对照GST和重组RABGAP1进行GST下拉分析。免疫印迹法检测这些蛋白的特异性相互作用。下部面板显示了车道上可比较的GST融合蛋白负载。CBB，考马斯亮蓝染色。c（c）转染有所示siRNA的A549细胞处于饥饿状态（3 h） 或饥饿和重新刺激（10 min）添加营养素。细胞裂解物通过免疫印迹分析。磷酸化蛋白的相对量如图2b所示进行量化。结果代表了两个独立的实验。d日转染有所示siRNA的A549细胞处于饥饿状态（3 h） 并重新刺激（10 min），然后用LAMP2（红色）和mTOR（绿色）抗体进行免疫染色。合并的图像显示在底部行中。图像是两个独立实验的代表。比例尺，10 微米。e（电子）TUFT1通过与RABGAP1的相互作用调节溶酶体定位、囊泡转运和mTORC1信号传导。说明TUFT1-RABGAP1在溶酶体定位、囊泡运输和mTORC1激活中作用的工作模型。
图6
图6。毒死蜱以水泡运输和mTORC1信号传导为靶点。
一二者之间的关系TUFT1型表达和毒死蜱敏感性。皮尔逊相关系数（r）和p值(P（P）)如图所示。27个细胞，其中我们获得了TUFT1型分析CCLE的表达谱和毒死蜱的50%生长抑制（GI50）值。b条用沃特曼（2）处理A549细胞 μM），MK-2206（2 μM），培氟膦（20 μM）或乙醇（10 μM）。细胞饥饿（2 h） 在所示抑制剂存在的情况下，使用LysoTracker Red（DND-99）额外添加1 h.然后用营养素重新刺激细胞（10 最小值）。用mTOR抗体对蛋白质进行免疫染色。图像是三个独立实验的代表。比例尺，10 微米。c（c）A549细胞处于饥饿状态（3 h） 在存在指示的抑制剂和重新刺激的情况下（10 min）添加营养素。用EEA1（红色）和mTOR（绿色）抗体固定细胞并进行免疫染色。显示合并的图形。比例尺，10 微米。图像是两个独立实验的代表。d日NCI-H460细胞处于饥饿状态（3 h） 或饥饿和重新刺激（10 min）在不含或含有指定浓度的毒死蜱的情况下添加营养素。细胞裂解物进行免疫印迹分析。磷酸化蛋白的相对量如图2b所示进行量化。结果代表了三个独立的实验。计算的IC50值显示在下表中。
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