Nucleoside reverse transcriptase inhibitor-induced rat oocyte dysfunction and low fertility mediated by autophagy

doi:10.18632/oncotarget.23243

.2017年12月13日；9(3):3895-3907.

doi:10.18632/noctarget.23243。 eCollection 2018年1月9日。

核苷逆转录酶抑制剂诱导的自噬介导的大鼠卵母细胞功能障碍和低生育率

李唐^1 2, 盛福阳^三, 华为王^1 4, 海古², 雪山夏⁵, 岳峰⁵, 杨泽兴¹, 赵树华¹, 苏存美¹, 苏振芳¹, 王昆华⁴

附属公司

¹昆明医科大学附属第一医院生殖与遗传学系，昆明，650032，中国云南省。
²云南省第一人民医院生殖医学科，中国云南省昆明市，650032。
^三云南省第一人民医院药学部，云南省昆明市，650032。
⁴云南省消化病研究所，昆明医科大学第一附属医院，昆明，650032，中国云南省。
⁵昆明科技大学生命科学系，昆明，650093，中国云南省。

PMID： 29423092
预防性维修识别码： PMC5790509
内政部： 10.18632/肿瘤靶点23243

核苷逆转录酶抑制剂诱导的自噬介导的大鼠卵母细胞功能障碍和低生育率

李唐等。 Oncotarget公司. 2017.

.2017年12月13日；9(3):3895-3907.

doi:10.18632/目标23243。 eCollection 2018年1月9日。

作者

李唐^1 2, 盛福阳^三, 华为王^1 4, Hai Gu公司², 雪山夏⁵, 岳峰⁵, 杨泽兴¹, 赵树华¹, 苏存美¹, 苏振芳¹, 王昆华⁴

附属公司

¹昆明医科大学附属第一医院生殖与遗传学系，昆明，650032，中国云南省。
²云南省第一人民医院生殖医学科，昆明，650032，中国云南省。
^三云南省第一人民医院药学部，云南省昆明市，650032。
⁴昆明医科大学第一附属医院云南消化疾病研究所，昆明，650032，中国云南省。
⁵昆明科技大学生命科学系，昆明，650093，中国云南省。

PMID： 29423092
预防性维修识别码：第579509页
内政部： 10.18632/目标23243

摘要

低生育率是核苷逆转录酶抑制剂（NRTIs）引起的最常见的副作用之一，然而这一过程的分子机制尚不清楚。本研究旨在探讨自噬是否在NRTIs诱导的雌性大鼠卵母细胞功能障碍和低生育能力中发挥作用。两者都有体内和在体外进行了实验。对于体内实验中，雌性成年Sprague-Dawley大鼠接受齐多夫定（AZT）和拉米夫定（3TC）灌胃治疗3、6、9和12周；还设置了一个控件。收集卵母细胞进行成熟评估，在体外受精和线粒体功能测定，凋亡和自噬分析。对于在体外实验中，收集卵母细胞并分配给对照组、3-甲基腺嘌呤（3-MA，一种有效的自噬抑制剂）、AZT、AZT+3-MA、3TC和3TC+3-MA组。卵母细胞与上述药物培养24、48和72小时，然后进行与体内研究。结果显示，卵母细胞成熟相关标记物水平、卵母细胞分裂率、囊胚形成率、线粒体DNA拷贝数和三磷酸腺苷水平以及细胞凋亡显著降低，且活性氧水平显著升高（所有P（P）-值<0.05）体内和在体外实验。除卵母细胞成熟相关标记物的变化外，这些变化被3-MA部分减弱。总之，我们证明NRTIs可导致大鼠卵母细胞功能障碍和低生育率，这种损伤至少部分由自噬介导。

关键词：NRTI；低生育率；线粒体毒性，自噬。

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利益冲突声明

无利益冲突。

数字

图1
通过测量MPF、GDF-9、TFG-β、IGF-1、KL和PDK1的水平来评估大鼠卵母细胞的成熟(**A–F**)酶联免疫吸附试验（ELISA），用于体内实验。用AZT和3TC处理大鼠3、6、9和12周，然后分离其卵母细胞以测量上述生物标记物。这里，a表示与对照组的统计显著差异(*P（P）*<0.05），b表示AZT组和3TC组之间具有统计学意义的差异(*P（P）*< 0.05).

图2
通过测量MPF、GDF-9、TFG-β、IGF-1、KL和PDK1的水平来评估大鼠卵母细胞的成熟(**A–F**)使用ELISA，用于*在体外*实验。卵母细胞用AZT和3TC处理24、48和72小时。这里，a表示与对照组的统计显著差异(*P（P）*<0.05），b表示AZT组和AZT+3-MA组之间，以及3TC组和3TC+3-MA各组之间具有统计学意义的差异(*P（P）*< 0.05).

图3
不同治疗组的卵母细胞分裂率和胚泡形成率体内实验(A类和B类)和*在体外*实验(C类和D类). AZT组和3TC组在不同时间点的发病率均显著低于对照组体内实验（全部*P（P）*-数值<0.05）。这里，a表示与对照组的统计显著差异(*P（P）*<0.05），b表示AZT组和AZT+3-MA组之间，以及3TC组和3TC+3-MA各组之间具有统计学意义的差异(*P（P）*< 0.05).

**图4。AZT和3TC对小鼠卵母细胞线粒体DNA拷贝数和线粒体功能相关基因表达的影响体内实验**
AZT组和3TC组大鼠分别患有AZT和3TC 3、6、9和12周。通过测量ND2基因含量来评估mtDNA拷贝数(A类). 甲基四氢叶酸(B类)和NRF-1(C类)测定线粒体功能。这里，a表示与对照组在统计上的显著差异*P（P）*<0.05，b表示AZT组和3TC组在*P（P）*< 0.05.

**图5。AZT和3TC对小鼠卵母细胞线粒体DNA拷贝数和线粒体功能相关基因表达的影响*在体外*实验**
通过测量ND2基因含量来评估mtDNA拷贝数(A类). 甲基四氢叶酸(B类)和NRF-1(C类)测定线粒体功能。这里，a表示与对照组的统计显著差异(*P（P）*<0.05），b表示AZT组和AZT+3-MA组之间，以及3TC组和3TC+3-MA各组之间具有统计学意义的差异(*P（P）*< 0.05).

**图6。AZT和3TC对小鼠卵母细胞ATP、cAMP和ROS水平的影响体内实验**
大鼠接受AZT和3TC治疗3、6、9和12周。ATP水平用ATP测定KiT测定(A类)用荧光素酶检测cAMP水平(B类). 此外，使用二氯二氢荧光素二乙酸酯检测线粒体中的活性氧水平(C类). 荧光强度与ROS水平一致(D类). 这里，a代表AZT、3TC和对照组在*P（P）*<0.05，b表示AZT组和3TC组在*P（P）*< 0.05.

**图7。AZT和3TC对大鼠卵母细胞ATP、cAMP和ROS水平的影响*在体外*实验**
ATP水平用ATP测定KiT测定(A类)用荧光素酶检测cAMP水平(B类); 用二氯二氢荧光素二乙酸酯检测线粒体中的活性氧水平(C类). 荧光强度与ROS水平一致(D类). 这里，a表示与对照组的统计显著差异(*P（P）*<0.05），b表示AZT组和AZT+3-MA组之间，以及3TC组和3TC+3-MA各组之间具有统计学意义的差异(*P（P）*< 0.05).

**图8。AZT和3TC对Bax和Bcl-2 mRNA表达的影响体内实验**
这里(A类)表示AZT、3TC和对照组在*P（P）*<0.05，（B）表示AZT组和3TC组在*P（P）*< 0.05.

**图9。AZT和3TC对Bax和Bcl-2 mRNA表达的影响*在体外*实验**
这里(A）表示与对照组的统计显著差异(*P（P）*<0.05），以及(B）表示AZT组和AZT+3-MA组之间，以及3TC组和3TC+3-MA各组之间的统计显著性差异(*P（P）*< 0.05).

**图10。AZT和3TC-诱导的卵母细胞自噬体内实验**
ATG5(A类)，ATG7(B类)和Beclin 1(C类)用qRT-PCR检测mRNA水平。这里，a代表AZT、3TC和对照组在*P（P）*<0.05，b表示AZT组和3TC组在*P（P）*< 0.05.

**图11。AZT和3TC-诱导的卵母细胞自噬*在体外*实验**
使用qRT-PCR分析ATG5（A）、ATG7（B）和Beclin 1（C）mRNA水平。使用Western blot（D）分析不同组的LC3-II和mTOR。这里，a表示与对照组的统计显著差异(*P（P）*<0.05），b表示AZT组和AZT+3-MA组之间，以及3TC组和3TC+3-MA各组之间具有统计学意义的差异(*P（P）*< 0.05).

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