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.2018年3月；19（3）：e45009。
doi:10.15252/embr.201745009。 Epub 2018年2月2日。

线粒体蛋白酶ClpP的缺失保护小鼠免受饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗

谢利什·巴斯卡兰 1, 加文·法老 1 2, 罗吉纳·兰吉特 1, 阿什利·墨菲 1, 松崎佐治 1, Binoj C Nair公司 三, 布列塔尼福布斯 1, 苏珊娜·吉斯佩特 4, 乔治·奥伯格 4, 肯尼思·汉弗莱斯 1, 迈克尔·金特 1, 蒂莫西·格里芬 1, 萨提亚西兰S迪帕 5
附属公司

线粒体蛋白酶ClpP的缺失保护小鼠免受饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗

谢利什·巴斯卡兰等。 EMBO代表. 2018年3月.

摘要

酪蛋白水解肽酶P（ClpP）是一种哺乳动物质量控制蛋白酶，被认为在线粒体未折叠蛋白反应（UPR）的启动中起重要作用百万吨)是一种逆行信号反应，有助于维持线粒体蛋白质的体内平衡。线粒体功能障碍与代谢紊乱的发展有关，了解缺陷UPR的影响百万吨代谢，ClpP敲除(氯丙烯-/-)对小鼠进行分析。氯丙烯-/-喂食老鼠随意减少了肥胖，反常地提高了胰岛素敏感性。缺乏ClpP会增加全身能量消耗，线粒体生物生成标记物在白细胞脂肪组织（WAT）中选择性上调氯丙烯-/-老鼠。当受到代谢压力（如高脂肪饮食）的挑战时，尽管热量摄入相似，氯丙烯-/-保护小鼠免受饮食诱导的肥胖、葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗和肝脂肪变性的影响。我们的结果表明，缺少ClpP会触发小鼠的代偿反应，并提示ClpP可能是哺乳动物UPR所必需的百万吨启动。因此，我们意外发现，小鼠缺乏ClpP对代谢有益。

关键词：脂肪组织；酪蛋白水解肽酶P；胰岛素敏感性；线粒体；肥胖。

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数字

图1
图1。氯丙烯 −/−小鼠脂肪减少，呼吸增强WAT公司

  1. WT的体重，氯丙烯 +/−、和氯丙烯 −/−喂食雄性小鼠随意5个月大时(n个= 8–10).

  2. WT的食物消耗，氯丙烯 +/−、和氯丙烯 −/−喂食老鼠随意，5个月大时体重正常化(n个= 8–10).

  3. WT中的脂肪质量和瘦肉质量，氯化钾 +/−、和氯丙烯 −/−通过定量磁共振成像对小鼠进行评估并根据体重年龄进行标准化(n个= 8–10).

  4. WT和氯丙烯 −/−小鼠（左侧面板，标度100μm，放大20倍）和gWAT切片平均脂肪细胞面积的定量（右侧面板）年龄(n个= 3).

  5. WT分化脂肪细胞油红O染色，氯丙烯 +/−、和氯丙烯 −/−小鼠（左侧面板，标度100μm，放大20倍）。从分化脂肪细胞中提取的总油红O的定量（右图）(n个= 3). 所示数据为三个独立实验的平均值±SEM。

  6. WT分化原代脂肪细胞培养中细胞生物能量学的图示，氯丙烯 +/−、和氯丙烯 −/−使用Seahorse Bioscience XF24细胞外通量分析仪有丝分裂应激试验（归一化为每孔蛋白质浓度）对小鼠进行测量。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。

  7. WT和WT分化脂肪细胞的免疫染色氯丙烯 −/−使用Tom20抗体的小鼠（左侧面板，标度100μm，放大20倍）和荧光强度定量（右侧面板）(n个= 3).

  8. WT和氯丙烯 −/−老鼠(n个= 3). 标度500 nm。放大5000倍。

数据信息：（A–G）条形代表平均值±SEM（ANOVA，*：WT vs。氯丙烯 −/−; #:氯丙烯 +/−与。氯丙烯 −/−; ^: WT与。氯丙烯 +/−; */# /^ P（P） < 0.05). WT：白色条，氯丙烯 +/−：灰色条，氯丙烯 −/−：黑条。
图2
图2。线粒体生物发生标记、线粒体伴侣和线粒体裂变/融合调节器OPA公司1在总重量（gWAT）属于氯丙烯 −/−老鼠

  1. 左侧面板：WT gWAT提取物的免疫印迹，氯丙烯 +/−、和氯丙烯 −/−PGC-1α、Tfam、VDAC、β-actin和ClpP小鼠(n个= 5). 右侧面板：定量斑点归一化为β‐肌动蛋白的图形表示。

  2. 量化WT gWAT中电子传递链（ETC）亚单位ATP5a1、ATP5ab、SDHA、SDHAB、SDHC和UQCRC2的蛋白质水平，氯丙烯 +/−、和氯丙烯 −/−质谱法获得的小鼠(n个= 5).

  3. WT和gWAT中mtDNA/nDNA含量的定量氯丙烯 −/−老鼠(n个= 6–8).

  4. 顶部面板：sWAT、BAT、心脏和肌肉提取物的免疫印迹氯丙烯 −/−小鼠PGC-1α和β-微管蛋白（Western blot显示n个= 4，量化基于n个= 6). 底部面板：归一化为β‐微管蛋白的定量斑点的图形表示。

  5. 左侧面板：WT和氯丙烯 −/−小鼠用于4‐HNE。右侧面板：以图形表示的整条线的带强度量化(n个= 5).

  6. 顶部面板：WT和氯丙烯 −/−P-AMPK和AMPK小鼠(n个= 5). 右侧面板：P‐AMPK与AMPK之比的图形表示。

  7. 左侧面板：WT gWAT提取物的免疫印迹，氯丙烯 +/−、和氯丙烯 −/−Lon、Hsp60、Hsp40、Hsp10、ClpX和ClpP小鼠(n个= 5). 右侧面板：定量斑点归一化为β‐肌动蛋白的图形表示。

  8. 蛋白质印迹显示OPA1亚型和β-actin在gWAT、sWAT、BAT、WT肌肉和心脏中的蛋白表达，以及氯丙烯 −/−小鼠（顶面板）（Western blot显示了n个= 2，量化基于n个= 5). 标准化为β‐肌动蛋白的斑点的量化如条形图所示（底部面板）。

数据信息：条形代表平均值±SEM（ANOVA，*：WT vs。氯丙烯 −/−; #:氯丙烯 +/−与。氯丙烯 −/−；^：WT与。氯丙烯 +/−;*/#/^ P（P） < 0.05). WT：白色条，氯丙烯 +/−：灰色条，氯丙烯 −/−：黑色条。
图3
图3。ClpP缺乏增加全身能量消耗和线粒体解偶联，并改变代谢酶的表达全球瓦特
WT代谢笼数据，氯丙烯 +/−、和氯丙烯 −/−老鼠。
  1. A–F

    耗氧率（OCR）标准化为体重（A），OCR标准化为瘦体重（B），EE标准化为重量（C），EE规范化为瘦身体质量（D），RER（E）和笼子活动（F）(n个= 6).

  2. G公司

    WT的gWAT和sWAT中UCP1和UCP2的转录水平氯丙烯 −/−老鼠(n个= 6–8).

  3. H（H）

    热图显示脂肪酸代谢（第一组）、葡萄糖代谢（第二组）、TCA循环、电子传递链（ETC）和其他线粒体蛋白质（第三组）和应激反应（解毒/抗氧化酶、伴侣蛋白、热休克蛋白和蛋白酶）中蛋白质表达的变化（第四组）以重量的gWAT为单位，氯化钾 +/−、和氯丙烯 −/−老鼠(n个= 5). WT的平均值用于标准化氯丙烯 +/−和氯丙烯 −/−老鼠。红色越深表示表达式增加越多，蓝色越深表示减少越多。

数据信息：（A–F）圆圈表示单个小鼠的数值。（A–G）条形代表平均值±SEM（ANOVA，*：WT vs。氯丙烯 −/−; #:氯丙烯 +/−与。氯丙烯 −/−; ^: WT与。氯丙烯 +/−; */#/^ P（P） < 0.05). WT：白色圆圈/条，氯丙烯 +/−：灰色圆圈/条，氯丙烯 −/−：黑色圆圈/条。
图4
图4。氯丙烯 −/−小鼠表现出改善的胰岛素敏感性
  1. A、 B类

    WT的葡萄糖耐量试验（A）和胰岛素耐量试验，氯丙烯 +/−、和氯丙烯 −/−喂食老鼠随意(n个= 6-8）。

  2. C类

    Western blots显示WT和WT中P‐Akt（T308）、Akt、β‐actin和ClpP的表达氯丙烯 −/−注射PBS（−Ins）或胰岛素（+Ins）的小鼠肌肉（第一组）、肝脏（第二组）和gWAT（第三组）（顶部）(n个= 3–4). P‐Akt/Akt的量化如底部面板所示。

  3. D–小时

    WT和WT中循环胰岛素（D）、葡萄糖（E）、甘油三酯（F）、游离脂肪酸（G）和脂联素（H）的水平氯丙烯 −/−处于喂食状态的小鼠(n个= 6–8).

数据信息：（A，B）圆圈代表平均值±SEM。（C–H）条形图代表平均值±SEM（方差分析，*：WT与。氯丙烯 −/−; #:氯丙烯 +/−与。氯丙烯 −/−;+：WT（−Ins）vs.WT（+Ins）；&:氯丙烯 −/−（−Ins）与。氯丙烯 −/−（+Ins）；$：WT（+Ins）与。氯丙烯 −/−（+Ins）*/#/+/&/$ P（P） < 0.05). WT：白色圆圈/条，氯丙烯 +/−：灰色圆圈/条，氯丙烯 −/−：黑色圆圈/条。
图5
图5。氯丙烯 −/−小鼠对饮食诱导的肥胖症有抵抗力，并且可以防止高频驱动诱导的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗

  1. WT体重的变化，氯丙烯 +/−、和氯丙烯 −/−喂食低脂饮食（LFD，实线）或高脂饮食（HFD，虚线）的小鼠(n个= 8–10). WT-白色圆圈，氯丙烯 +/−-灰色三角形，氯丙烯 −/−-黑色正方形。

  2. 定量磁共振分析显示脂肪质量（左侧面板）和瘦肉质量（右侧面板），与体重标准化(n个= 8–10).

  3. 不同脂肪库的重量，按体重标准化（gWAT-性腺白脂肪组织、sWAT-皮下WAT和BAT-棕色脂肪组织）(n个= 8–10).

  4. WT和氯丙烯 −/−喂食LFD或HFD的小鼠。比例尺100μm，放大20倍。

  5. 将腓肠肌（左）和股四头肌（右）的组织重量标准化为体重(n个= 8–10).

  6. WT的肝脏重量，氯丙烯 +/−、和氯丙烯 −/−喂食LFD或HFD的小鼠（左图，n个= 8–10）和肝组织切片的H&E染色氯丙烯 −/−喂食LFD或HFD的小鼠。比例尺100μm，放大20倍。

  7. WT的葡萄糖耐量试验，氯丙烯 +/−、和氯丙烯 −/−喂食LFD或HFD的小鼠（左图）(n个= 8–10). 曲线下的面积以图形方式表示（右侧面板）。

  8. WT的胰岛素耐受性试验，氯丙烯 −/−、和氯丙烯 +/−喂食LFD或HFD的小鼠（左侧面板）(n个= 8–10). 曲线下面积的图形表示（右侧面板）。

  9. LFD或HFD喂养的WT和氯丙烯 −/−禁食16小时的小鼠，以及LFD或HFD喂养的WT和氯丙烯 −/−处于喂食状态的小鼠(n个= 8–10).

数据信息：条形代表平均值±SEM（ANOVA，*：WT vs。氯丙烯 −/−; #:氯丙烯 +/−与。氯丙烯 −/−.@：同一基因型不同饮食的变化*/#/@ P（P） < 0.05). WT：白色圆圈/条，氯丙烯 +/−：灰色圆圈/条，氯丙烯 −/−：黑色圆圈/条。
图6
图6。线粒体呼吸增加总重量（gWAT）属于高频驱动‐馈电氯丙烯 −/−老鼠

  1. 用底物组合谷氨酸、苹果酸和ADP测量电子传递链（ETC）复合物I连接的OXPHOS(n个= 6).

  2. 用底物组合谷氨酸、苹果酸、ADP、琥珀酸、细胞色素c和鱼藤酮测定ETC复合物II连接的OXPHOS(n个= 6).

  3. ETC复合物I和II连接的OXPHOS，或ETC的最大OXPHOS容量（P），用底物组合谷氨酸、苹果酸、ADP、琥珀酸和细胞色素c测量(n个= 6).

  4. 有底物（谷氨酸和苹果酸）和无ADP时线粒体内膜质子泄漏相关的耗氧量(n个= 6).

  5. 存在底物（谷氨酸、苹果酸和琥珀酸）和ADP但添加寡霉素抑制ATP合成酶时线粒体内膜质子泄漏相关耗氧量(n个= 6).

数据信息：条形代表平均值±SEM（ANOVA，*：WT vs。氯丙烯 −/−; #:氯丙烯 +/−与。氯丙烯 −/−. */# P（P） < 0.05). WT：白色条，氯丙烯 +/−：灰色条，氯丙烯 −/−：黑色条。
图7
图7。线粒体生物发生标记升高保存在总重量（gWAT）属于高频驱动‐馈电氯丙烯 −/−老鼠

  1. Western blots显示LFD或HFD喂养的野生型和野生型野生型的gWAT中PGC‐1α、Tfam、VDAC、ClpP和β‐tubulin的蛋白表达氯丙烯 −/−鼠标（左侧面板）(n个= 4). 归一化为β微管蛋白的蛋白质定量如右图所示。

  2. Western blots显示了喂食LFD或HFD的WT和氯丙烯 −/−鼠标（左侧面板）(n个= 4). 归一化为β微管蛋白的蛋白质定量如右图所示。

数据信息：条形代表平均值±SEM（ANOVA，*：WT vs。氯丙烯 −/−; @: 同一基因型不同饮食的变化*/@ P（P） < 0.05). WT：白色条，氯丙烯 +/−：灰色条，氯丙烯 −/−：黑色条。
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