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.2018年3月30日；293(13):4767-4777.
doi:10.1074/jbc。M117.816785。 Epub 2018年2月6日。

己糖激酶2和核因子红细胞相关因子2在应激胶质瘤细胞中转录共激活黄嘌呤氧化还原酶的表达

图塞夫·谢赫 1, 皮尤什·古普塔 1, 普鲁特维·戈达 1, 什鲁蒂·帕特里克 1, 埃洛拉·森 2
附属公司

己糖激酶2和核因子红细胞相关因子2在应激胶质瘤细胞中转录共激活黄嘌呤氧化还原酶的表达

图塞夫·谢赫等。 生物化学杂志. .

摘要

众所周知，代谢适应、炎症反应和氧化还原稳态的动态网络会推动肿瘤进展。这些流程之间存在相当大的重叠，但其中几个关键监管机构仍然未知。为此，我们研究了促炎细胞因子IL-1β在连接胶质瘤细胞中这些过程中的作用。我们发现，葡萄糖饥饿使胶质瘤细胞对IL-1β诱导的凋亡敏感，其方式依赖于活性氧物种（ROS）。虽然IL-1β诱导的JNK对葡萄糖剥夺下的细胞存活率没有影响，但它介导了己糖激酶2（HK2）的核移位。这一事件伴随着sirtuin 6（SIRT6）、核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）和黄嘌呤氧化还原酶（XOR）水平的升高。SIRT6不仅诱导ROS介导的细胞死亡，而且促进核Nrf2-HK2相互作用。将Nrf2-HK2复合物招募到XOR启动子上的ARE位点调节其表达。重要的是，在siRNA-介导的Nrf2和HK2敲除实验中，HK2作为Nrf2的转录辅激活子调节XOR表达，XOR水平降低。我们的结果强调了HK2作为Nrf2转录辅激活子在促炎和代谢应激条件下调节XOR表达的非代谢作用。我们的见解还强调了HK2的核活性在调节氧化还原稳态相关基因中的重要性。

关键词：SIRT6；c-Jun N末端激酶（JNK）；葡萄糖；己糖激酶；白细胞介素1（IL-1）；核因子2（类红细胞衍生因子）（NFE2L2）（Nrf2）。

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利益冲突声明

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数字

图1。
图1。
葡萄糖饥饿使胶质瘤细胞以活性氧依赖的方式对IL-1β诱导的凋亡敏感。 A类，IL-1β诱导胶质瘤细胞在葡萄糖剥夺下死亡。B类，DHE荧光强度增加，说明葡萄糖剥夺IL-1β处理细胞中ROS生成增加。C类，吸光度增加表示ROS抑制剂NAC拯救了细胞死亡。D类，蛋白质印迹显示，在没有葡萄糖的情况下，用IL-1β处理的神经胶质瘤细胞中pJNK水平增加。E类MTS分析显示JNK非依赖性细胞死亡。这个插入显示了JNK抑制剂的功效。这些图表示散点图，每个数据点表示描述胶质瘤细胞活性的平均吸光度值(A类,C类、和E类)和描述活性氧水平的平均荧光强度(B类). −克表示无葡萄糖DMEM。SP600125是一种JNK抑制剂。采用单因素方差分析（Bonferroni多重比较试验）进行统计分析。误差线代表S.E(n个=4英寸A类,C类、和E类;n个=3英寸B类). ***,第页< 0.001.
图2。
图2。
SIRT6通过调节氧化还原稳态影响细胞活力。 A类Western blot显示IL-1β处理的胶质瘤细胞在有或无葡萄糖的情况下SIRT6水平。印迹是三个显示类似结果的独立实验的代表性图像。重制β-肌动蛋白印迹，以建立等效负荷。显示了描述SIRT6表达在所示处理条件下相对于对照组的倍数变化的密度测定数据，这些处理条件归一化为相应的负荷控制。siRNA-介导的SIRT6敲除增加(B类)SIRT6过度表达减少(C类)MTS法测定经IL-1β处理的无糖胶质瘤细胞的存活率。插图在里面B类和C类显示SIRT6 siRNA的敲除效率，并在转染SIRT6过表达结构后增加SIRT6表达。D类和E类DHE荧光强度显示，葡萄糖剥夺IL-1β处理细胞中ROS的生成是SIRT6依赖性的。F类，SIRT6在炎症和代谢应激的联合作用下调节SOD2的表达。密度测定数据显示，在标准化为相应负荷控制的指示处理条件下，SOD2表达相对于对照组的倍数变化。散点图中的每个数据点代表描述胶质瘤细胞活性的平均吸光度值(n个= 4) (B类和C类)和荧光值描述了独立实验中所示处理条件下的活性氧水平(n个= 3) (D类和E类).−克表示无葡萄糖DMEM。NSsiRNA，非特异性siRNA；SIRT6OE公司，SIRT6过度表达。双尾配对学生t吨测试(B类和C类)和单因素方差分析（Bonferroni多重比较检验）(A类,D类,E类、和F类)用于统计分析。误差线代表S.E.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001;纳秒，不显著。
图3。
图3。
IL-1β诱导HK2依赖JNK的核定位。显示的是显示胞浆的蛋白质印迹(A类)和核能(B类)在有或无葡萄糖的情况下，用IL-1β治疗的胶质瘤细胞中HK2水平。C类qRT-PCR分析显示，在葡萄糖剥夺条件下，IL-1β处理的细胞中IL-1β和NLRP3 mRNA水平增加。散点图中的每个数据点代表无葡萄糖DMEM（−克)来自独立实验(n个= 4).D类Western blot显示在有或无葡萄糖的情况下，经IL-1β或SP600125处理的细胞中的核HK2水平。Western blot是三个独立实验的代表性图像，显示了类似的结果。重制β-肌动蛋白或c23的印迹，以确定等效负荷。E类，JNK调节HK2的核定位。免疫荧光显微镜显示，在IL-1β存在下，核HK2定位于葡萄糖剥夺细胞。用JNK抑制剂（SP600125）治疗可阻止HK2定位于细胞核。细胞用抗HK2免疫染色(香港2号;红色). 细胞核标记有DAPI(蓝色). 合并的图像(合并)如图所示。63×的代表性图像放大倍率根据三个独立的实验显示了所示条件。服务提供商表示JNK抑制剂（SP600125）。相邻线剖面图显示了ZEN lite 2.3软件测量的HK2和DAPI的平均荧光强度(比例尺，10μm）。误差线代表S.E.*，第页< 0.05.
图4。
图4。
SIRT6监管Nrf2–HK2协会。 A类，Western blot显示IL-1β处理的胶质瘤细胞在葡萄糖饥饿状态下核Nrf2表达升高。B类Western blot分析显示，siRNA-介导的SIRT6基因敲除可阻止IL-1β处理的细胞在葡萄糖饥饿状态下的核Nrf2积聚。重新对c23进行斑点试验，以确定等效负荷。C类，SIRT6在存在IL-1β的情况下，积极调节葡萄糖缺乏胶质瘤细胞中的核HK2–Nrf2相互作用。共免疫沉淀显示，在siRNA介导的SIRT6敲低后，IL-1β处理的葡萄糖缺乏细胞中HK2-Nrf2的结合减少。在每种条件下，几乎相等的IgG水平排除了不均匀沉淀对相互作用研究的混杂影响。印迹是三个显示类似结果的独立实验的代表性图像。NSsiRNA，非特异性siRNA；知识产权免疫沉淀；IB公司，免疫印迹。
图5。
图5。
HK2在调节XOR表达中充当Nrf2的辅激活子。 A类，IL-1β增加了葡萄糖剥夺条件下的XOR水平。siRNA介导的Nrf2基因敲除(B类)或HK2(C类)如Western blot分析所示，阻止IL-1β诱导的葡萄糖剥夺细胞XOR表达。插图显示Nrf2和HK2 siRNA的敲除效率。Western blot图像代表了三个显示类似结果的独立实验。重制β-肌动蛋白印迹，以建立等效负荷。显示了不同处理条件下XOR表达相对于对照组的-倍变化的密度测定数据，这些处理条件归一化为相应的载荷控制。散点图中的每个数据点表示相对于独立实验控制的折叠变化(n个= 3).D类和E类在T98G和U87MG胶质瘤细胞中XOR启动子上包含ARE位点的区域上进行的ChIP表明，IL-1β处理的葡萄糖剥夺细胞中ARE位点上的Nrf2和HK2结合增加。F类ChIP分析显示，在IL-1β处理的葡萄糖剥夺细胞中，siRNA-介导的Nrf2敲低后，XOR启动子处HK2结合降低。稀释输入（5%）用作阳性对照。在校正背景信号后，计算相对于对照水平的相对富集度。图是三个独立实验的代表性数据克表示葡萄糖剥夺的DMEM。采用单因素方差分析（Bonferroni多重比较试验）进行统计分析。误差线代表S.E.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.克，示意性描述了HK2作为Nrf2的辅激活子在炎症和代谢应激下XOR调节中的重要性。NSsiRNA，非特异性siRNA；定量PCR，定量PCR。
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