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.2018年4月1日；27(7):1290-1300.
doi:10.1093/hmg/ddy044。

星形胶质细胞：Lafora型进行性肌阵挛癫痫的新参与者

卡拉·鲁比奥·维莱纳 1, 罗莎·维亚纳 1, 何塞·博内特 1, 玛丽亚·阿德莱达·加西亚-吉梅诺 2, 玛尔塔·卡萨多 1 三, 米盖尔·赫雷迪亚 4, 帕斯科尔·桑兹 1 4
附属公司

星形胶质细胞：Lafora型进行性肌阵挛癫痫的新参与者

卡拉·鲁比奥·维莱纳等。 人类分子遗传学. .

摘要

拉福拉病（Lafora disease，LD）是一种致命的进行性肌阵挛性癫痫，其特征是在大脑和外周组织中积聚名为拉福拉小体（Lafora-body，LBs）的不溶性分支不良的糖原样内含物。在大脑中，自1911年首次发现以来，人们假设这些糖原内含物只存在于受影响的神经元中。最近已经获得了LD小鼠模型，我们和其他人已经能够报告LD动物大脑中糖原内含物的积累，这再次说明了该疾病的特征。在这项工作中，我们提出的证据表明，尽管在LD糖原包涵体与神经元共同定位的小鼠模型中，正如最初建立的那样，它们中的大多数与星形细胞标记物共同定位，如胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和谷氨酰胺合酶。此外，我们观察到，LD小鼠模型星形胶质细胞的原代培养物积累的糖原水平高于对照组。这些结果表明，星形胶质细胞可能在Lafora病的病理生理学中起着关键作用，因为这些细胞中糖原内含物的积累可能会影响其正常功能，从而导致可能的神经元功能障碍。

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数字

图1。
图1。
对照组和对照组脑糖原内含物的免疫组织荧光分析埃普m2b-/-12个月大的老鼠。用抗糖原抗体和二级抗IgM AlexaFluor（红色）633结合抗体孵育每种类型三只独立小鼠的海马和小脑的侧断面。然后用DAPI染色切片以显示细胞核。使用徕卡DM RXA2显微镜采集图像。展示了具有代表性的图像。比例尺：100µm。底部面板：剖面Epm2b公司-/-按照材料和方法一节中的描述，用α-淀粉酶对小鼠进行预处理，然后按上述方法进行IHF分析。DG，海马齿状回；GL，小脑颗粒层。
图2。
图2。
使用抗Tuj1和抗糖原抗体进行免疫共定位实验。海马、小脑和脑桥的三个独立侧面切片Epm2b公司-/-分别使用抗Tuj1（神经元标记物）和抗糖原抗体以及次级抗兔AlexaFluor（绿色）488和抗IgM AlexaFlu（红色）633结合抗体对12个月大的小鼠进行免疫检测。然后用DAPI染色切片以显示细胞核。使用徕卡DM RXA2显微镜采集图像。展示了具有代表性的图像。比例尺：100µm和10μm。CA1，海马山茱萸1；GL：小脑颗粒层；PC、Purkinje细胞。白色箭头表示含有糖原内含物的神经元细胞。
图3。
图3。
使用抗GlnS或抗GFAP和抗糖原抗体进行免疫共定位实验。三个独立的海马体的侧面切片Epm2b公司-/-使用抗GlnS（星形细胞标记物）组合对12个月大的小鼠进行免疫检测(A类)或抗GFAP（星形细胞标志物）(C类)抗糖原抗体、二级抗兔AlexaFluor（绿色）488和抗IgM AlexaFlu（红色）633结合抗体。然后用DAPI染色切片以显示细胞核。使用徕卡DM RXA2显微镜采集图像。呈现了具有代表性的图像。比例尺：10μm。CA1，海马山茱萸1；DG，海马齿状回。白色箭头表示含有糖原内含物的星形胶质细胞。使用徕卡TCS SP8共焦显微镜从类似制剂中获取图像(B类，抗GlnS；天，抗GFAP）。显示Z堆栈中的四个连续图像。
图4。
图4。
使用抗Iba1和抗糖原抗体进行免疫共定位实验。(A类)三个独立的海马体侧面切片Epm2b公司-/-分别使用抗Iba1（小胶质细胞标记物）和抗糖原抗体以及次级AlexaFluor（绿色）488和抗IgM AlexaFlu（红色）633结合抗体对12个月大的小鼠进行免疫检测。然后用DAPI染色切片以显示细胞核。使用徕卡DM RXA2显微镜采集图像。展示了具有代表性的图像。比例尺：10μm。CA1，海马山茱萸1。白色箭头表示含有糖原内含物的小胶质细胞。(B类)使用徕卡TCS SP8共焦显微镜从类似制剂中获取图像。显示Z堆栈中的四个连续图像。
图5。
图5。
LD小鼠模型的原代皮质星形胶质细胞积累更高水平的糖原。(A类)7天龄对照组皮质星形胶质细胞的原代培养，Epm2a公司-/-和Epm2b公司-/-小鼠在含有高糖的培养基（25m）中生长米然后，按照材料和方法一节中的描述测量糖原含量。(B类)上述星形胶质细胞原代培养物在高糖条件下培养24小时，然后将其转移到不添加葡萄糖的培养基中培养6和24小时，并按照材料和方法一节中的描述测量糖原含量。(C类)上述星形胶质细胞的原代培养物在高糖条件下生长24小时。然后，用300μ米DAB或20米的组合米全日空航空公司4Cl和100μ米leupeptine再服用1小时。然后，将细胞转移到不添加葡萄糖或不添加相应抑制剂的培养基中6小时。然后，按照材料和方法一节中的描述测量糖原含量。所表达的结果是每个基因型中至少三个独立批次的星形胶质细胞的平均值。在（B）和（C）中，结果被归一化为相应基础条件下的糖原水平（高糖；虚线）。条形图表示标准偏差。在（A）中，LD星形胶质细胞与对照组之间存在显著差异(**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001). 在（B）和（C）中，糖原水平与基础条件（高糖）之间存在显著差异(**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001).
图6。
图6。
在图5图例所述条件下生长的初级皮质星形胶质细胞的Western blot分析。使用适当的抗体（见材料和方法部分），通过免疫印迹法分析图5所述处理的皮质星形胶质细胞原代培养物的粗提物（30μg）。C、 控制；五十、 ：Epm2a公司-/-; M、，Epm2b公司-/-星形胶质细胞。分子量如左图所示。对至少三批独立的星形胶质细胞进行了典型的印迹分析。使用ImageJ软件（2.0.0版）测量相应条带的强度。给出了不同蛋白质的强度图。折叠变化值是不同测量值的平均值，条形图表示标准偏差，并表示每个基因型中蛋白质水平相对于基础条件（高糖）的显著差异(#P（P）< 0.05,$P（P）< 0.05,&P（P）< 0.05，用于对照，Epm2a公司-/-和Epm2b公司-/-分别）。高血糖；NG，不添加葡萄糖；NG DAB，不添加葡萄糖外加300μ米轻而快地擦掉；NG N/L，未添加葡萄糖加上20 m米全日空航空公司4Cl和100μ米亮佩汀。
图7。
图7。
在高糖（25 m）中生长的皮质星形胶质细胞原代培养物的呼吸能力分析米葡萄糖）或转移到不含葡萄糖的培养基中培养12小时。记录的参数为：初始呼吸（基础）、耦合效率（ATP连接）、质子泄漏、最大呼吸速率、储备能力和非线粒体呼吸（现在称为剩余氧耗量）。按照“材料和方法”一节中的描述进行计算。结果按照mtDNA含量标准化，表示为每个基因型中至少三个独立批次的星形胶质细胞的平均值。条形图表示标准偏差。
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