Insulin-degrading enzyme is not secreted from cultured cells

doi:10.1038/s41598-018-20597-6

.2018年2月5日；8(1):2335.

doi:10.1038/s41598-018-20597-6。

培养细胞不分泌胰岛素降解酶

恩寿颂¹, 大卫·W·罗杰斯², 路易·B·赫什^三

附属公司

¹美国肯塔基大学分子和细胞生物化学系及结构生物学中心，肯塔基州列克星敦市，邮编40536。
²美国肯塔基大学分子和细胞生物化学系及结构生物学中心，肯塔基州列克星敦市，邮编40536。davidrodgers@uky.edu。
^三美国肯塔基大学分子和细胞生物化学系及结构生物学中心，肯塔基州列克星敦市，邮编40536。lhersh@uky.edu。

PMID： 29402917
预防性维修识别码：项目编号5799172
内政部： 10.1038/s41598-018-20597-6

培养细胞不分泌胰岛素降解酶

恩寿颂等。科学代表. 2018.

.2018年2月5日；8(1):2335.

doi:10.1038/s41598-018-20597-6。

作者

恩寿颂¹, 大卫·W·罗杰斯², 路易·B·赫什^三

附属公司

¹美国肯塔基大学分子和细胞生物化学系及结构生物学中心，肯塔基州列克星敦市，邮编40536。
²美国肯塔基大学分子和细胞生物化学系及结构生物学中心，肯塔基州列克星敦市，邮编40536。davidrodgers@uky.edu。
^三美国肯塔基大学分子和细胞生物化学系及结构生物学中心，肯塔基州列克星敦市，邮编40536。lhersh@uky.edu。

PMID： 29402917
预防性维修识别码：项目编号5799172
内政部： 10.1038/s41598-018-20597-6

摘要

胰岛素降解酶（IDE）在生物活性肽的分解代谢中起作用。已确定的作用包括降解胰岛素和淀粉样β肽（Aβ），将其与糖尿病和阿尔茨海默病联系起来。IDE主要位于胞浆中，一个长期存在的问题是它如何获得肽底物。报告表明，由非常规途径分泌的IDE参与胰岛素和Aβ的细胞外水解。我们发现，从培养的HEK-293或BV-2细胞中释放的IDE仅占细胞总IDE的约1%，远远低于以前的报道。重要的是，乳酸脱氢酶（LDH）和其他细胞溶质酶的释放处于相同的相对水平，这表明细胞外IDE是由细胞完整性的丧失而非分泌造成的。据报道，洛伐他汀增加了BV-2细胞的IDE释放，但LDH的释放反映了这种释放。细胞活性分析表明，洛伐他汀会导致细胞完整性的丧失，从而解释其对IDE释放的影响。IDE存在于BV-2细胞条件培养基中富含外显体的部分，但它仅占总细胞酶的~0.01%，不太可能是IDE的重要来源。这些结果对IDE的分泌及其在细胞外肽降解中的重要性提出了质疑。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
HEK-293细胞释放IDE和LDH。HEK-293细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中培养。在指定的时间段，取等分样品用于IDE的Western blot分析(■) 或LDH(◻). 释放的%基于培养基中的Western blot信号相对于总Western blot信号（培养基加细胞裂解物）。指示点是五个独立实验结果的平均值，误差线表示测量值的标准偏差+/-。这些线显示线性回归拟合IDE值（实线）或LDH值（虚线）。

图2
文献报道，在各种生长条件下，BV-2细胞向培养基中释放IDE和LDH。BV-2细胞在DMEM培养基（顶面板）、补充N2的DMEM介质（中面板）或含有或不含10%FBS的RPMI介质（下面板）中培养。在指定的时间段，取等分样品并用于IDE的Western blot分析（+FBS■, −FBS公司▲, 实线）或LDH（+FBS⏹，−FBS公司△, 虚线）。释放%基于培养基中的蛋白质印迹信号相对于总蛋白质印迹信号（培养基加细胞裂解物）。结果是除DMEM中IDE外，每种情况下2-5个独立试验的平均值+无血清的N2和有血清的RPMI中的IDE，这是一系列测量的结果。误差条指示 +/− 平均值的标准偏差。

图3
洛伐他汀对RPMI培养基中BV-2细胞IDE和其他蛋白释放的影响。BV-2细胞在DMEM培养基中培养24小时有（+）或无（−）5时为h µM洛伐他汀。收集条件培养基并通过Western blot分析测定IDE、LDH、GAPDH和垂体后叶素。细胞在平板上裂解，裂解液用于测量细胞内蛋白质的数量。释放百分比基于培养基中的Western blot信号相对于总Western blot信号（培养基加细胞裂解物）。IDE和LDH的值是三个独立试验的平均值，GAPDH和垂体后叶素的值来自单个试验。误差条指示+/-平均值的标准偏差。

图4
释放到介质中的IDE和其他细胞溶质蛋白部分与外泌体相关。BV-2细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中培养24小时有（+）或无（−）5时为h µM洛伐他汀。无细胞条件培养基在12000℃离心 × 克对于30 4时的最小值 °C以获得P2颗粒分数。P2组分的上清液在100000下离心 × 克颗粒外泌体（P3）。P2和P3颗粒在100中再次悬浮通过Western blot分析对PBS的µL以及上清液（S3）和细胞裂解液中的指示蛋白质进行分析。为了分析所有标记物，运行了两个SDS-PAGE凝胶。转移到PVDF膜后，以分子量标准为指导，将膜切割成条状。将第一膜的顶部切割在刚好低于100KDa分子量标记物的位置并用于IDE蛋白质印迹，将第二切割在刚好高于50KDa分子量标记物的位置并用于Bip。在37KDa分子量标记处进行另一次切割，此片段用于肌动蛋白蛋白质印迹。37 KDa分子量标记下方的片段用于LDH Western blot。将第二个凝胶的PVDF膜切至75KDa分子量标记和用于Alix Western印迹的顶部下方。在37KDa分子量标记处进行第二次切割，该中间片段用于Flotillin蛋白质印迹，而PVDF膜的下部片段用于GAPDH蛋白质印迹。显示了整个印迹条。

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