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.2018年1月；15（1）：864-872。
doi:10.3892/etm.2017.5482。 Epub 2017年11月10日。

SDHB下调通过AMPK功能促进结直肠癌的增殖和侵袭，但不包括参与有氧糖酵解调节的功能

肖志明 1, 刘少军 1, 飞燕艾 1 2, 熊晨 1, 李夏雨 1 2, 刘瑞（Rui Liu） 1, 伟国人 1 2, 张雪梅 1 2, 彭淑 1 2, 张德才 1 2
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SDHB下调通过AMPK功能促进结直肠癌的增殖和侵袭，但不包括参与有氧糖酵解调节的功能

肖志明等。 实验治疗学. 2018年1月.

摘要

琥珀酸脱氢酶B（SDHB）功能丧失是有氧糖酵解和癌症进展的易感因素。一磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）参与有氧糖酵解的调节和癌症的不同特征。本研究探讨了AMPK是否介导了SDHB在有氧糖酵解和肿瘤生长中的调节作用。采用免疫印迹法检测大肠癌（CRC）和正常组织中SDHB和AMPK的表达。HT-29 CRC细胞用于建立在体外异位过度表达和SDHB敲除模型。在CRC组织中，SDHB下调，而AMPK和磷酸化AMPK（Thr172）上调。SDHB功能丧失或获得的实验表明，该蛋白通过影响AMPK的表达和活性而负调控AMPK。然而，SDHB和AMPK被鉴定为抑制CRC细胞中的乳酸生成，表明它们都对有氧糖酵解有抑制作用。因此，SDHB对有氧糖酵解的调节不太可能通过AMPK介导。SDHB敲除促进HT-29细胞的存活、迁移和侵袭，而抑制AMPK则表现出相反的效果。SDHB过表达损害了细胞迁移和侵袭，这种作用在AMPK激活后被逆转。这些结果表明AMPK可能介导SDHB在CRC细胞增殖和迁移中的作用。总之，CRC细胞中SDHB的下调可能会增加AMPK活性，从而促进这些癌细胞的增殖和侵袭。然而，SDHB对有氧糖酵解的调节可能与AMPK无关。需要进一步研究来阐明SDHB调节有氧糖酵解的机制。

关键词：腺苷一磷酸活化蛋白激酶；有氧糖酵解；大肠癌；琥珀酸脱氢酶-B。

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数字

图1。
图1。
大肠癌组织中SDHB和AMPK的表达谱。共从患者身上获得23个CRC和23个副癌组织。Western blotting检测SDHB、AMPK和p-AMPK的蛋白表达水平。给出了具有代表性的western印迹图像*与副癌组织相比，P<0.05，**P<0.01。琥珀酸脱氢酶-B；p-AMPK，磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶α；结直肠癌；T172，Thr172。
图2。
图2。
CRC HT-29细胞中SDHB的异位过度表达和敲除。将四个靶向SDHB的shRNAs和一个打乱的siRNA转染到HT-29细胞中。将人SDHB开放阅读框插入增强型绿色荧光蛋白质粒C1载体中，构建SDHB过表达载体。（A） 荧光照片显示转染效率（放大倍数，×400）。（B） Western blot分析检测HT-29细胞中SDHB蛋白的表达*与对照组相比，P<0.05，**P<0.01。琥珀酸脱氢酶-B；结直肠癌；短发夹RNA；控制；OV、SDHB表达载体；sh1，SDHB-homo-305；sh2，SDHB-homo-447；sh3，SDHB-homo-498；第4页，SDHB-homo-779。
图3。
图3。
SDHB对CRC细胞AMPK的抑制作用。SDHB在HT-29 CRC细胞中过度表达或被敲除。总共加入0.1mM AICAR（AMPK激活剂）和20µm/l化合物C（AMPK抑制剂），分别激活和抑制AMPK的活性。进行蛋白质印迹分析以检测HT-29细胞中SDHB、AMPK p-AMPK（Thr172）和p-ACC的蛋白质水平*P<0.05和#与相应的对照组相比P＜0.05。琥珀酸脱氢酶-B；p-AMPK，磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶α；结直肠癌；AICAR，5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸；OV、SDHB表达载体；Act，AMPK激活剂；shR，shRNA靶向SDHB；Inh、AMPK抑制剂；ACC，抗p-乙酰-CoA羧化酶。
图4。
图4。
SDHB和AMPK对CRC细胞有氧糖酵解的影响。SDHB在HT-29 CRC细胞中过度表达或被敲除。向细胞中分别添加总共0.1 mM AICAR（AMPK激活剂）和20µm/l化合物C（AMPK-抑制剂）以激活和抑制AMPK的活性。使用乳酸检测试剂盒评估细胞内乳酸水平*与对照组相比，P<0.05。琥珀酸脱氢酶-B；腺苷一磷酸活化蛋白激酶；结直肠癌；AICAR，5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸；OV、SDHB表达载体；shR，shRNA靶向SDHB；Act，AMPK激活剂；Inh、AMPK抑制剂。
图5。
图5。
SDHB对CRC细胞ADP/ATP比值的影响。SDHB在CRC HT-29细胞中过度表达或被敲除。使用ApoSENSOR™ADP/ATP比值检测试剂盒评估ADP/ATP比率*与对照组相比，P<0.05。琥珀酸脱氢酶-B；三磷酸腺苷；ADP，腺苷5′-二磷酸；结直肠癌。
图6。
图6。
SDHB通过AMPK调制介导对CRC细胞不同特征的调节。SDHB在CRC HT-29细胞中过度表达或被敲除。共添加0.1 mM AICAR（AMPK激活剂）和20µm/l化合物C（AMPK-抑制剂）来分别激活和抑制AMPK的活性。分别使用（A）MTT和（B）流式细胞术分析评估细胞活力和凋亡。（C） Western blot分析检测p21/WAF1和caspase-3的表达。使用（D）伤口愈合（放大倍数，×200；Con表示0h时间点）和（E）侵袭（放大倍数×400）分析评估细胞迁移和侵袭*P<0.05，**P<0.01，#P<0.05和##与相应的对照组相比，P<0.01。琥珀酸脱氢酶-B；结直肠癌；腺苷一磷酸活化蛋白激酶；AICAR，5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸；OV、SDHB表达载体；Act，AMPK激活剂；shR，shRNA靶向SDHB；Inh、AMPK抑制剂；FITC，膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素。
图7。
图7。
SDHB对裸鼠CRC生长的影响及AMPK的作用。HT29电池（1×106)用SDHB过表达载体或空载体转染，然后注射到每只小鼠背部左侧（每组3只小鼠）。注射后12天，每天皮下注射5 mg/kg（体重）AICAR（AMPK抑制剂）一次，持续6天。在注射细胞20天后取出肿瘤。（A） Western blotting检测SDHB、AMPK和p-AMPK（Thr172）的表达。（B） 给出了异种移植瘤的图像并确定了肿瘤体积*P<0.05，#P<0.05和&与相应的对照组相比，P<0.05。琥珀酸脱氢酶-B；结直肠癌；腺苷一磷酸活化蛋白激酶；AICAR，5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸；OV、SDHB表达载体；动作，AMPK激活剂。
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