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.2018年4月;37(17):2285-2301.
doi:10.1038/s41388-017-0093-z。 Epub 2018年2月5日。

脂肪细胞诱导的CD36表达促进卵巢癌的进展和转移

附属公司

脂肪细胞诱导的CD36表达促进卵巢癌的进展和转移

安德拉斯·拉塔尼等。 癌基因. 2018年4月.

摘要

卵巢癌(OvCa)的特点是腹膜腔广泛快速转移。内脏脂肪细胞通过为肿瘤生长提供脂肪酸(FA)来促进这一过程。然而,脂肪酸从脂肪细胞转移到癌细胞的确切机制仍然未知。本研究表明,与原代人网膜脂肪细胞共同培养的OvCa细胞在质膜中表达高水平的FA受体CD36,从而促进外源性FA的摄取。使用CD36抑制剂和短发夹RNA敲除去除脂肪酸衍生FA的OvCa细胞可阻止脂肪酸诱导的恶性表型的发展。具体而言,抑制CD36可减弱脂肪酸诱导的胆固醇和脂滴积聚,并降低细胞内活性氧(ROS)含量。代谢分析表明,CD36在OvCa细胞在富含脂肪的微环境中的生物能量适应中发挥着重要作用,并控制着其代谢可塑性。此外,CD36的缺失影响了在腹膜播散中起因果作用的细胞过程,包括粘附、侵袭、迁移和非锚定生长。腹腔注射CD36缺陷细胞或用抗CD36单克隆抗体治疗可降低小鼠异种移植瘤的肿瘤负担。此外,原发性和转移性人类卵巢肿瘤的匹配队列显示,转移组织中CD36上调,这一发现在三个公共基因表达数据集中得到证实。这些结果表明,网膜脂肪细胞通过上调OvCa细胞中的CD36来重新编程肿瘤代谢。通过抑制CD36靶向基质-肿瘤代谢界面可能被证明是对抗OvCa转移的有效治疗策略。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。脂肪细胞诱导卵巢癌细胞CD36表达
(a)在指定时间点与人原代脂肪细胞(HPA)共同培养的OvCa细胞系中CD36蛋白表达的Western blot分析。(b)与HPA共培养24 h的三种不同OvCa细胞系中FA转运蛋白FABPpm、FATP1和FATP4的Western blot分析。(c)在缺乏(-)和存在(+)HPA的情况下,共焦免疫荧光显微镜检查显示的脂肪酸转运体。脂肪酸转运体用绿色荧光检测,质膜用红色荧光(小麦胚芽凝集素)检测,细胞核用Hoechst 33258(蓝色)复染。(d)CD36蛋白的亚细胞定位。OvCa细胞要么与HPA共同培养,要么在无血清培养基(SFM)中生长。16小时后,对细胞进行裂解以获得总细胞裂解物(TCL),或将其分为细胞质(CP)和质膜(PM)组分。
图2
图2。CD36的抑制减少了脂肪细胞诱导的脂肪酸摄取和脂质积聚
(a)共焦免疫荧光显微镜检测CD36。SKOV3ip1细胞单独培养或与HPA培养指定时间,并固定在玻璃盖玻片上,然后与CD36一级抗体和Alexa-488结合二级抗体(绿色)培养。细胞核用Hoechst 33258(蓝色)复染。比例尺,10μm。(b和c)脂肪细胞条件培养基(CM)和CD36特异性抑制剂Sulfo-N-Succinimidyl Oleate(SSO)对亲代细胞(SKOV3ip1)、扰乱控制(SKOV 3ip1 shRNA-scramble)和CD36-shRNA转导细胞(SKO V3ip1-shRNA-CD36)随时间的影响。癌细胞(2.5×105)血清饥饿并且当指示时与脂肪细胞CM和/或不可逆CD36抑制剂SSO孵育。在指定的时间点,用荧光标记的脂肪酸(BODIPY-FA)和无毒的细胞免疫猝灭剂(Q-Red.1)测量FA的转运。从细胞中排除猝灭试剂会导致来自细胞内BODIPY-FA的荧光信号强度增加。如材料和方法所述,用荧光板阅读器量化细胞内FA水平的变化***p<0.001。(d)与HPA培养的亲代细胞(SKOV3ip1)、扰乱控制细胞(SKO V3ip1-shRNA-scramble)和CD36 shRNA转导细胞(SKO3ip1-shRNA-CD36)中的细胞内脂质积累。共培养16小时后,用BODIPY 493/503对中性脂滴(LD)进行染色,用图像J计算LD总面积。Bars表示3个独立实验的平均值±标准偏差(n.s.,不显著,**p<0.01)显示了细胞LD积聚的典型免疫荧光图像(绿色LD,BODIPY 493/503,蓝色细胞核,Hoechst 33258)。
图3
图3。脂肪细胞共培养卵巢癌细胞的微阵列分析
(a)人类原代脂肪细胞(HPA)共培养改变的典型途径。根据使用右尾Fisher精确检验计算的显著性(p值)对途径进行排序。每条路径的p值由条形图表示,表示为p值对数的-1倍。(b)天才网络分析。网络8,HPA刺激引起的脂质代谢变化。基因产物表示为节点,而两个节点之间的生物关系表示为一条线。红色和绿色分别表示上调和下调。颜色强度与变化程度相关。白色基因的表达没有明显变化。
图4
图4。CD36缺失影响细胞代谢
(a)Western blot分析在指定的时间点,在没有(-)和存在(+)人类原代脂肪细胞(HPA)的情况下,对打乱控制和CD36 shRNA转导细胞(CD36 shRNA)中的总AMP-活化蛋白激酶(总AMPKα)和磷酸-AMPK(p-AMPKβ)水平进行分析。p-AMPK抗体识别AMPK催化亚单位中的T172。(b)糖酵解功能。使用或不使用脂肪细胞条件培养基(CM)培养扰码控制(SKOV3ip1 shRNA-Scramble)和CD36 shRNA转导细胞(SKOV3ip1 shaRNA-CD36)。用Seahorse XF24分析仪测量细胞外酸化(ECAR)率。数据是七个重复的平均值±标准偏差。(c)基本耗氧率。使用或不使用脂肪细胞条件培养基(CM)培养扰码控制(SKOV3ip1 shRNA-Scramble)和CD36 shRNA转导细胞(SKOV3ip1 shaRNA-CD36)。使用Seahorse XF24分析仪测量OCR、氧化磷酸化和ATP生成。数据为四次重复的平均值±s.e.m。(d)胆固醇测定。在人类原代脂肪细胞存在和不存在(+HPA)的情况下,使用荧光法通过胆固醇氧化反应测定细胞内胆固醇的积累。所有显示的数据均为平均值,±s.e.m.(n=3)**p<0.01,n.s.,不显著。数据是三个独立实验的代表。(e)TBAR分析。用荧光测量法测定人原代脂肪细胞中不存在和存在(+HPA)时丙二醛(MDA)的形成,以定量氧化脂质的生成。所有显示的数据均为平均值,±标准误差(n=3)**p<0.01,*p<0.05。数据是三个独立实验的代表。
图5
图5。CD36沉默对体外SKOV3ip1细胞侵袭、迁移、粘附和克隆形成能力的影响
(a)亲代(SKOV3ip1)、扰码载体(SKOV3ip1 shRNA-scramble)和CD36 shRNA-1转导(SKOV 3ip1 shRNA-CD36)细胞向无血清培养基(SFM)或原代人类脂肪细胞(HPA)的侵袭(左)和迁移(右)。用Image-J对侵入和迁移的细胞进行计数。数据是三次独立实验的代表***p<0.001。(b)SKOV3ip1 shRNA-CD36细胞与所示细胞外基质蛋白的粘附。荧光标记的SKOV3ip1细胞被镀到涂有所示ECM组件的96个板上。洗涤板,并通过测量荧光强度和标准曲线来定量粘附细胞的数量。CD36 shRNA转导细胞与打乱载体相比的粘附百分比变化,并归一化为多聚赖氨酸包被孔。条形代表两个独立实验的平均值±标准偏差(n=5)**p<0.01。(c)菌落形成。将SKOv3ip1细胞(4000)置于软琼脂上;33天后,菌落用结晶紫染色并计数。这些数据代表三个独立的实验,列代表三个不同井的平均值**p<0.01,无显著性差异。显示了染色菌落的代表性图像。
图6
图6。CD36抑制降低体内肿瘤生长
转移的异种移植模型。雌性无胸腺小鼠腹腔注射(a)1×106扰乱载体或CD36 shRNA转导SKOV3ip1细胞,32天后或(b)5×106OVCAR-8细胞。肿瘤接种一周后,每天给动物注射抗CD36单克隆抗体或其同型对照,治疗4周。实验结束时,对肿瘤进行计数、切除和称重。测定肿瘤转移数(顶部)和肿瘤重量(底部)。每个点代表一个单独的动物,水平线代表平均值(***p<0.001,**p<0.01)。显示了来自四种不同动物的网膜和腹膜肿瘤结节的代表性图像。箭头显示肠系膜肿瘤结节,虚线突出网膜和腹膜转移。
图7
图7。卵巢癌转移中相对CD36 mRNA水平增加
(a)散点图显示了激光显微切割的高级别浆液性人类卵巢肿瘤及其相应的大网膜转移瘤(n=10)相对CD36mRNA水平的实时定量PCR比较。绘制了成对转移和原发OvCa样本的对数比,>1在转移中较高(n=7),<1在转移中较低(n=3)。p<0.05,通过配对Wilcoxon Signed Ranks检验得出。(b)原发性和转移性高级别浆液性卵巢癌中CD36表达的肿瘤素分析。对包含原发性肿瘤以及网膜转移(顶行)或腹膜转移(底行)的Oncomine数据集进行CD36表达查询。方框图例:+方框内表示平均值,方框内的条表示中值,上部条表示分布的最大值,p值和折叠变化显示在每个图形的x轴下方。所有p值代表学生的t检验。Oncomine上的数据是公开的,引用包含在补充数据中。

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