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.2018年4月19日;25(4):413-425.e6。
doi:10.1016/j.chembiol.2018.01.007。

缺锰细胞和小鼠线粒体超氧化物歧化酶转化为促氧化剂过氧化物酶

附属公司

缺锰细胞和小鼠线粒体超氧化物歧化酶转化为促氧化剂过氧化物酶

道格拉斯·加尼尼等。 细胞化学生物学. .

摘要

超氧自由基阴离子(O2⋅‒)呼吸过程中不断产生其他活性氧。在线粒体中,O的歧化2⋅‒由线粒体超氧化物歧化酶2(SOD2)加速,SOD2是一种传统上与抗氧化保护有关的酶。然而,SOD2表达增加促进氧化应激,表明SOD2可能具有促氧化作用。在这里,我们发现通常与锰结合的SOD2可以结合铁并产生具有过氧化物酶活性的替代异构体。从锰到铁的转换允许FeSOD2利用H2O(运行)2促进氧化应激。我们发现FeSOD2在培养细胞和体内形成。FeSOD2导致培养细胞和体内线粒体功能障碍和较高水平的氧化应激。我们表明,FeSOD2的形成将抗氧化防御转化为促氧化过氧化物酶,导致多种人类疾病中的细胞变化。

关键词:SOD2;自由基;铁;锰;金属;线粒体;线粒体活性氧;线粒体代谢;线粒体超氧化物歧化酶;氧化应激;过氧化物酶。

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利益声明

作者声明没有利益冲突。

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图1
图1。FeSOD2的过氧化物酶活性
(A类)在含有0.2 mg/mL SOD2(8.6μM)、100μM Amplex Red和860μM H的样品中测定Amplex Red氧化2O(运行)2(100当量SOD2,μM:μM),在100 mM磷酸盐缓冲液中制备,pH 7.4,25μM DTPA。(B类)H的影响2O(运行)2用ELISA研究SOD2中自由基的形成。样品中含有0.2 mg/mL SOD2(8.56μM)和不同浓度的H2O(运行)2(表示为μM:μM相当于SOD2),在100 mM磷酸缓冲液中制备100 mM DMPO,pH 7.4,25μM DTPA,37o(o)C.通过添加200 U/mL过氧化氢酶停止反应。(C类)在黑暗中培养1小时后,含有10μM FeSOD2、100μM Amplex Red和H的样品2O(运行)2(表示为FeSOD2的μM:μM当量)分析了它们的最终再吸收收率。样品在pH 7.4的100 mM磷酸盐缓冲液中制备,25°C下使用25μM DTPA。(D类)用ELISA法测定含有10μM FeSOD2、100 mM DMPO和H的样品中蛋白质自由基的形成2O(运行)2(表示为μM:与FeSOD2的μM当量);如有指示,样品中还含有100μM Amplex Red(E类)样品含有10μM FeSOD2、100 mM DMPO、500μM H2O(运行)2如有说明,还含有100μM Amplex Red或去铁胺(DFO)。样品在100 mM磷酸盐缓冲液中制备,pH 7.4,25μM DTPA。通过添加200 U/mL过氧化氢酶停止反应。显示SOD2和CAT波段。(F类)研究了含有10μM FeSOD2,MnCl的样品中Amplex Red的氧化2或Fe(NH4)2(所以4)2,100μM安培红,1 mM高2O(运行)2和25μM DTPA或25μM EDTA,在pH 7.4的100 mM磷酸盐缓冲液中制备,在25°C的黑暗中培养1h。数据表示为平均值±SD。另请参阅补充图S1.*表示第页-值<0.05与对照和&表示第页-值<0.05,如图所示。
图2
图2。SOD2过表达细胞在常规培养基中过氧化物酶FeSOD2的形成
(A类)含或不含10%胎牛血清(ATCC®)的RPMI 1640培养基(含谷氨酰胺的高糖,Gibco®,Life Technologies)的铁和锰含量。完整培养基还含有1 mM丙酮酸、0.4 mM尿苷、50μg/mL基因素、100μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素。金属通过ICP-OES定量。(B类)SOD2蛋白质丰度和(C类)在常规培养基或补充锰的培养基(25μM MnCl)中培养21天的MCF-7衍生对照细胞(neo)和SOD2-过表达细胞(Mn11)的SOD特异性活性2). (D类)通过ICP-OES对来自neo和Mn11细胞的纯化SOD2进行金属分析。用Amplex红氧化法测定从neo和Mn11细胞纯化的SOD2的过氧化物酶活性(E类)通过蛋白质自由基的形成(F类). 在含有20μg/mL SOD2、100μM H的样品中测量Amplex Red氧化2O(运行)2和在pH 7.4的100mM磷酸盐缓冲液中用25μM DTPA制备的100μM Amplex Red。在黑暗中培养的样品的Amplex Red氧化与图中所示的没有区别,图中样品每5分钟暴露在仪器光下60分钟。in(F)样品按(E)中所述制备,但Amplex红色被省略,DMPO(100 mM)被添加。数据表示为平均值±SD。另请参阅补充图S2.*表示第页-与对照组相比,数值<0.05;&表示第页-值<0.05,如图所示;NS表示无统计学显著差异,第页-值>0.05,如图所示。
图3
图3。FeSOD2对细胞线粒体代谢的影响
(A类)通过量化24小时内分泌到培养基中的乳酸来评估糖酵解。(B类)在基础条件下或在存在葡萄糖摄取抑制剂2-脱氧葡萄糖(50 mM,持续30分钟)的情况下,在细胞中测定细胞内ATP。在(C类)描述了细胞线粒体不同复合体的代表性Western blot。从总细胞匀浆(每车道30μg蛋白质)制备样品,并使用层粘连蛋白B1染色作为负荷控制。复合物IV和II染色的密度测定见补充图S3A和B。数据表示为平均值±标准偏差。*表示第页-值<0.05与对照组(基础neo细胞);#表示第页-与基础值相比,数值<0.05;&表示第页-值<0.05,如图所示;NS表示无统计学显著差异,第页-值>0.05,如图所示。
图4
图4。抗氧化剂MnSOD2代替过氧化物酶FeSOD2对Mn11细胞基于基因本体的基因集的改变
通过微阵列和GSEA分析,显示了抗氧化剂MnSOD2而非过氧化FeSOD2在细胞中积累的影响。将Mn11中补充锰的效果与在等基因亲本细胞系neo中检测到的补充锰的非MnSOD2效果进行了比较,Mn11特别促进MnSOD2的形成,而非FeSOD2。最后的对比是(MnMn11-Mn11)与(Mnneo-neo)。补充图S3C中提供了这种对比的信息图。基因集通过归一化富集评分(NES)进行排序。B–H和补充图S3D–F显示了有助于顶部基因集富集的基因的热图。
图5
图5。含有FeSOD2的细胞对松散细胞活力的敏感性增加,并在线粒体中累积损伤
亲本细胞系neo和过表达SOD2的细胞系Mn11暴露于(A)100μM H2O(运行)21小时,(B–C)50 mU/mL葡萄糖氧化酶(GOX)4小时,或(D)750μM百草枯10小时(A类)在用H处理的细胞中测定细胞活力2O(运行)2使用MTT分析持续1小时。(B类)MtDNA损伤或(C类)用50 mU/mL GOX处理细胞4小时,测定线粒体蛋白自由基的形成。在(C)中,培养基中也含有40 mM DMPO。(D类)用40 mM DMPO孵育细胞,然后用百草枯(750μM)处理10 h。制备荧光免疫组织化学用于检测蛋白中心自由基(红色的抗DMPO)。在共焦显微镜成像之前,用DAPI(蓝色核染色)将载玻片覆盖在安装介质上。描述了具有代表性的图像。数据表示为平均值±标准偏差。*表示第页-与对照组相比,数值<0.05;&表示第页-值<0.05,如图所示;NS表示无统计学显著差异,第页-值>0.05,如图所示。
图6
图6。喂食缺锰饮食或富铁饮食的动物显示肝脏中的铁蓄积和锰缺乏
动物被喂食控制、铁或锰控制的饮食4周。收集并储存PBS灌注的肝脏、新鲜分离的小鼠肝线粒体和血液。全肝匀浆中铁(黑条)和锰(灰条)的浓度(A类)和分离的线粒体(B类)通过ICP-OES测定。在(C类)用ICP-MS测定全血中的锰浓度。同时,检测全肝匀浆样品中的看家蛋白和糖酵解酶GAPDH、线粒体复合物III和SOD2(图S6C)。在(D类)显示了密度计(OD,A.U.)。补充图S5A中提供了关于动物方案的附加信息。数据表示为平均值±标准偏差。*表示第页-与对照组相比,数值<0.05;&表示第页-值<0.05,如图所示;NS表示无统计学显著差异,第页-值>0.05,如图所示。
图7
图7。喂食缺锰饮食或富铁饮食的动物表现出线粒体损伤和过氧化物酶FeSOD2的积累
用对照、铁或锰操纵的饮食喂养动物4周。(A类)测定整个肝脏中SOD的活性。对于(B–D)所示的实验,动物在处死前1小时注射DMPO(1g/kg),获得肝脏和新鲜分离的线粒体。用酶联免疫吸附法测定分离线粒体中的蛋白质自由基(B类)通过Western印迹(C类). 在(D类)从肝线粒体样品中分离出线粒体复合物I,并进行抗DMPO Western blotting(蛋白质自由基)。在(E类)在分离的肝线粒体样品中测定了复合物I+III、II+III和柠檬酸合成酶的活性。如前所述,从全肝匀浆中分离出天然SOD2用于细胞。在(F类)从小鼠肝脏中分离的SOD2用于通过形成SOD2蛋白自由基检测过氧化物酶活性。样品含有35μM SOD2(0.87 mg/mL)、100 mM DMPO和250μM H2O(运行)2如果存在,100μM Amplex Red.In(G公司),用ICP-MS测定从小鼠肝脏分离的SOD2中的铁(黑条)和锰(灰条)浓度。数据表示为平均值±标准偏差。*表示第页-与常规饮食相比,数值<0.05。

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引用人

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