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.2018年2月3日；7(2):14.
doi:10.1038/s41389-017-0014-6。

Let-7 microRNA通过致癌转录因子髓样锌指-1控制侵袭性溶酶体变化

Siri Amanda Tvingsholm先生 1, 马琳·布雷达尔·汉森 1, Knut Kristoffer Bundgaard Clemmensen公司 1, 迪特玛丽布里克斯 1, 博·拉芬 1, 丽莎·B·弗兰克尔 2, Riku Louhimo公司 三, 何塞·莫雷拉 4, 桑普萨·豪塔尼埃米 三, 伊琳娜·格罗莫娃 5, Marja Jäättelä 6, 图拉·卡尔伦基 7
附属公司

Let-7 microRNA通过致癌转录因子髓样锌指-1控制侵袭性溶酶体变化

Siri Amanda Tvingsholm先生等。 肿瘤发生. .

摘要

癌细胞利用溶酶体进行侵袭和转移。髓样锌指1（MZF1）是一种ErbB2应答转录因子，通过上调溶酶体组织蛋白酶B和L促进乳腺癌细胞的侵袭。这里我们确定let-7 microRNA，一种乳腺癌中著名的肿瘤抑制因子，作为MZF1的直接负调控因子。对原发性乳腺癌组织的分析显示，MZF1从正常乳腺上皮逐渐上调为浸润性导管癌，并且几个let-7家族成员与MZF1 mRNA呈负相关，提示let-7和MZF1之间的反向调节关系可能在浸润性乳腺癌的发生发展中起作用。此外，我们发现MZF1调节ErbB2阳性乳腺癌细胞中的溶酶体贩运。与此一致，MZF1缺失或let-7表达抑制溶酶体的侵袭性顺行运输和ErbB2表达的MCF7球体的侵袭。本文的结果将MZF1和let-7与ErbB2阳性乳腺癌细胞中的溶酶体过程联系起来，而非癌细胞中主要与转录因子EB有关。将MZF1和let-7鉴定为侵袭性乳腺癌细胞中溶酶体分布的调节因子，将癌症相关的、促进侵袭的溶酶体改变与正常溶酶体功能解耦，从而为癌症溶酶体的治疗靶向开辟了新的可能性。

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利益冲突声明

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数字

图1
图1。MZF1在原发性乳腺癌样本中的表达增加，其表达可诱导低侵袭性乳腺癌细胞的癌细胞侵袭。
一正常乳腺（上面板）、1级乳腺癌组织（DCIS；中面板）、1-2级乳腺癌组（下面板）中MZF1（棕色）的IHC染色示例。切片用苏木精（蓝色）复染，图像用20倍放大镜拍摄。b条包括321份正常和乳腺癌组织的原发性乳腺癌样本在内的TMA中MZF1蛋白表达与肿瘤分级的关系。采用ACIS辅助定量IHC分析TMA，取重复核心的ACIS得分平均值，并与乳腺癌分级进行绘图。正常和1-2级（IDC）之间MZF1表达的统计差异用*表示，表示第页-价值 < 0.05，根据Mann-Whitney测试。平均值 +/− SD用红色标记。c（c）MZF1在来自同一TMA的1–3级正常、良性和原发性乳腺肿瘤中的表达(b条).d日在缺乏（−Dox）或存在强力霉素（+Dox）的情况下，用含有MZF1（MCF7-MZF1 1–6）或3D Matrigel中的空载体（MCF7矢量）的强力霉素诱导表达载体稳定转染的MCF7细胞的侵袭。图像放大10倍拍摄。外生长平均范围的量化(d日)使用ImageJ完成。对于每个处理的4个球体中的每一个，估计入侵细胞所走过的10个最大距离，并计算每个处理的平均生长量。给出的数据是2个独立实验的平均值，作为非诱导对照（−Dox）的%，MCF7-MZF1 1–6细胞中−Dox和+Dox的比较用***表示第页 < 韦尔奇的0.0001t吨-测试。电子免疫印迹分析MZF1在MCF7载体和MCF7-MZF1 1-6（+Dox）中的表达，以及不含（−Dox）多西环素。β-actin作为等负荷对照。使用ImageJ对来自单个对照实验的免疫印迹进行定量，将其标准化为β-肌动蛋白，并以MCF7载体−Dox的%表示
图2
图2。MZF1 3′-UTR含有一个假定的let-7靶点，MZF1的表达与几个let-7家族成员呈负相关，与原发性乳腺癌标本中的LIN28A呈正相关。
一9个let-7家族成员在MZF1 3′-UTR（红色）中与其假定目标位置对齐。预计所有let-7家族成员都会通过一个7mer种子区域（绿色）与目标位点结合，但let-7e与一个8mer种子区的结合除外。b条TCGA数据中包含的原发性乳腺癌样本中let-7和MZF1 RNA表达之间的相关图。显示正相关的配对用红色圆圈表示。显示负相关的配对用蓝色圆圈表示。斯皮尔曼相关系数用圆的半径表示：系数越大，半径越大。c（c）TCGA数据中MZF1和LIN28A表达的相关图（所有阶段）。图中省略了表达量最高的6%的LIN28A样本，以更好地显示相关性。相关性用***赋值，表示第页 < 0.001.d日TCGA中MZF1和LIN28B表达的相关图（所有阶段）。电子如图1a-c所示，MZF1和Lin28A蛋白表达之间的关联由相同的TMA定量。Spearman相关性与第页 < 0.0001
图3
图3。Let-7 miRNAs通过直接结合其3′-UTR来调节MZF1的表达。
一福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）MCF10A和MCF7细胞颗粒制成的切片中MZF1的代表性IHC染色。切片用苏木精（蓝色）复染，图像用40倍放大镜拍摄。采用ACIS辅助分析定量MCF10A和MCF7细胞中MZF1的表达。b条Let-7在MCF10A和MCF7细胞中的表达。使用TaqMan miRNA分析和qPCR定量let-7d、let-7e、let-7f、let-7g和let-7i的表达。使用U6 RNA作为内部参考，通过2-ΔCt计算相对miRNA数量。U6 RNA在MCF10A和MCF7细胞中的表达水平相似。数据表示为两个独立实验和三个技术副本的平均值 ± SD。根据let-7e-和let-7g-表达对MCF10A和MCF7细胞进行比较时，指定**表示第页 < 0.01和****表示第页 < 0.0001（韦尔奇）t吨-测试。c（c）let-7d、let-7e和let-7的作用 g模拟（20 nM）在MZF1 mRNA水平上相对于MCF7细胞中的非靶向对照模拟物。以PPIB为参考基因，通过RT-qPCR定量MZF1 mRNA表达。数据表示为六个（let-7d和let-7e）和五个（let.7g）独立实验的平均值 ± SD和显著性用*表示第页 < 韦尔奇0.05t吨-测试。d日miRNA抑制剂LNA1、LNA2和LNA3（20 nM）相对于MCF7细胞中LNA阴性对照靶向不同let-7家族成员的MZF1mRNA表达。数据表示为三个独立实验的平均值 ± SD和显著性用*和**表示第页 < 0.05和第页 < 韦尔奇0.01t吨-分别进行测试。电子对let-7池（let-7d，let-7e和let-7g，20）的MZF1蛋白表达的免疫印迹分析 nM）或LNA池（LNA1和LNA3，20 nM）。β-actin用于控制等负荷。免疫印迹是使用ImageJ定量的三个独立印迹的代表。数据表示为三个实验的平均值 ± SD相对于对照。显著性用*表示第页 < 韦尔奇t检验为0.05。（f）用20 let-7d、let-7e和let-7的nM g模拟物和在SKBR3、MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞中的非靶向对照。β-actin用于控制等负荷。免疫印迹是三个独立印迹的代表。克荧光素酶报告试验测定hluc + − psiCHECK-2-MZF1、突变psiCHEC-2-MZF1和阳性对照psiCHECK-2–2xlet-7对let-7d、let-7e和let-7g（20 nM）。数据表示为psiCHECK-2-MZF1和突变psiCHEC-2-MZF1的12个独立实验的平均值，以及psiCHECK-2–2xlet7的4个独立实验。数据表示为实验平均值 ± 与控制模拟和重要性相关的SD用*、**、***和****表示第页 < Welch’s中的0.05、0.01、0.001和0.0001t吨-分别进行测试
图4
图4。Let-7 miRNAs通过减少MZF1的表达抑制侵袭性乳腺癌细胞的侵袭。
一转染20后3D Matrigel中MCF7-p95ΔNErbB2细胞的侵袭 nM对照、let-7d、let-7e和let-7g模拟物和MZF1 siRNA。以10倍放大率拍摄侵入性球体的图像。外生长平均范围的量化(一)使用ImageJ完成。对于每个处理的5个球体中的每一个，估计入侵细胞所走过的10个最大距离，并计算每个处理的平均生长量。数据以控制模拟的%表示，let-7e和MZF1kd的效果用*、**和***表示第页 < 0.05,第页 < 0.01，以及第页 < 0.001，在韦尔奇t吨-测试。b条用对照组和20 nM let-7e模拟物，在缺乏3′-UTR的瞬时表达WT MZF1的情况下。侵入性球体的图像以10倍的放大倍数拍摄。量化如所述一数据以控制百分比表示，let-7e的效果用*表示第页 < 韦尔奇0.05t吨-测试。c（c）转染20 在WT MZF1短暂过度表达的情况下，进行nM对照和let-7e模拟。β-actin用于控制等负荷。免疫印迹用Image Studio Lite定量。在没有短暂WT MZF1过度表达的情况下，数据是相对于对照模拟治疗的。d日MCF7-p95ΔNErbB2细胞中ErbB2蛋白表达的免疫印迹分析 nM）。β-actin用于控制等负荷。免疫印迹是使用Image Studio Lite定量的三个独立实验的代表。数据表示为实验平均值± SD相对于对照。根据韦尔奇的说法，这种影响并不显著t吨-测试
图5
图5。Let-7 miRNAs通过减少MZF1的表达来逆转ErbB2诱导的溶酶体外周分布。
一二甲基亚砜或5处理的MCF7-p95ΔNErbB2细胞溶酶体分布的共焦免疫荧光显微镜图像 24μM拉帕替尼 h.处理后，固定细胞，并用Hoechst（蓝色）对溶酶体膜蛋白LAMP2（绿色）、细胞骨架α-微管蛋白（红色）和细胞核进行染色。量化(一)通过分析溶酶体的分布特点，确定溶酶体主要分布在核周、散在或周围，每63×图像中有8～15个细胞，每次治疗5张图像。数据表示五幅图像的平均百分比分布± SD.拉帕替尼对溶酶体外周池的影响用***表示第页 < 0.001（韦尔奇氏）t吨-测试。b条共聚焦免疫荧光显微镜观察转染20 nM的非靶向对照、let-7d、let-7e和let-7g模拟物和MZF1 siRNA（MZF1kd），以及在缺乏3′-UTR的瞬时表达WT MZF1存在时的非靶控和let-7e模拟物。量化(b条)已按照中的描述完成(一). let-7模拟物和MZF1 siRNA对溶酶体外周池的作用用*、**和***表示第页 < 0.05,第页 < 0.01，以及第页 < 0.001（韦尔奇氏）t吨-测试。A和B中的数据代表了三个独立的实验
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