The peroxisome biogenesis factors posttranslationally target reticulon homology domain-containing proteins to the endoplasmic reticulum membrane

doi:10.1038/s41598-018-20797-0

.2018年2月2日；8(1):2322.

doi:10.1038/s41598-018-20797-0。

过氧化物酶体生物发生因子翻译后靶向内质网膜的网织红同源结构域蛋白

山本雅素¹, Toshiaki Sakisaka先生²

附属公司

¹神户大学医学研究生院生理与细胞生物学系膜动力学系，神户，650-0017，日本。
²神户大学医学研究生院生理与细胞生物学系膜动力学系，神户，650-0017，日本。sakisaka@med.kobe-u.ac.jp。

PMID： 29396426
预防性维修识别码：项目编号：5797116
内政部： 10.1038/s41598-018-20797-0

过氧化物酶体生物发生因子翻译后靶向内质网膜的网织红同源结构域蛋白

山本雅素等。科学代表. 2018.

.2018年2月2日；8(1):2322.

doi:10.1038/s41598-018-20797-0。

作者

山本雅素¹, Toshiaki Sakisaka先生²

附属公司

¹神户大学医学研究生院生理与细胞生物学系膜动力学系，神户，650-0017，日本。
²神户大学医学研究生院生理与细胞生物学系膜动力学系，神户，650-0017，日本。sakisaka@med.kobe-u.ac.jp。

PMID： 29396426
预防性维修识别码：项目编号：5797116
内政部： 10.1038/s41598-018-20797-0

摘要

内质网（ER）由一类含有网织蛋白同源结构域（RHD）的膜蛋白形成，该结构域是一个保守的疏水结构域，包含两个短发夹跨膜结构域。RHD位于内质网膜的外叶，产生高曲率内质网。虽然大多数注定要进入分泌途径的膜蛋白是共翻译靶向的，并插入到ER膜中，但含有RHD的蛋白是如何靶向并插入ER膜的分子机制仍有待阐明。在这里，我们表明含有RHD的蛋白质可以翻译后靶向ER膜。PEX19是一种细胞溶质过氧化物酶体，可选择性识别含RHD的新生蛋白，并与膜过氧化物酶PEX3协同调节其翻译后靶向性。因此，这些过氧化物酶体生物生成因子为含RHD蛋白的膜插入提供了一种替代的翻译后途径，这意味着内质网膜形成和过氧化物酶生物生成可能由翻译后膜插入协调。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
将含RHD的蛋白质翻译后靶向ER膜。用1 mM环己酰亚胺，与半渗透HeLa细胞孵育，然后用抗FLAG pAb和抗PDI mAb进行免疫染色。箭头表示通过3xFLAG-Arl6IP1或3xFLAG-Rtn4C与PDI共定位判断的翻译后靶向内质网膜。棒材，20 微米。

图2
PEX19作为一种蛋白质的鉴定，该蛋白质选择性地结合到含有RHD的新生蛋白质。(A类)从兔网织红细胞裂解物中纯化Arl6IP1结合蛋白。将合成FLAG-Arl6IP1的兔网织红细胞裂解物与抗FLAG单克隆抗体固定化琼脂糖孵育。为了检查污染，未合成FLAG-Arl6IP1（对照裂解物）的兔网织红细胞裂解物也与抗FLAG单克隆抗体固定化琼脂糖孵育。结合蛋白通过与大量过量的游离FLAG肽竞争洗脱，然后进行SDS-PAGE，然后进行银染色。p120、p60、p55、p40和p29被鉴定为Bat3（也称为Bag6），蛋白酶体26 质谱法分别测定S亚单位ATP酶1、SRP54、PEX19和核糖体蛋白L10a。(B类)PEX19与含RHD的新生蛋白质的选择性结合。在合成FLAG-Arl6IP1、FLAG-Rtn4C、FLAG-atlastin-1和FLAG-syntaxin-1的兔网织红细胞裂解物中添加1 mM嘌呤霉素，然后与抗FLAG单克隆抗体固定化琼脂糖孵育。用SDS样品缓冲液煮沸洗脱结合蛋白，然后进行SDS-PAGE，然后用抗PEX19 pAb和抗FLAG pAb进行Western印迹。

图3
PEX19选择性地介导Arl6IP1靶向ER膜。(A类)PEX19过度表达诱导Arl6IP1而非VAP-A的扩散定位。将HA-Arl6IP1或HA-VAP-A转染到HeLa细胞中，加入或不加入FLAG-PEX19 C296S，然后用抗HA单克隆抗体、抗FLAG单克隆抗体和抗PDI单克隆抗体进行免疫染色。棒材，20 微米。(B类)PEX19过度表达诱导的弥散定位的量化。随机选择50个转染细胞(A类)并计数显示HA-Arl6IP1或HA-VAP-A的扩散定位的细胞的数量。HeLa细胞也转染HA-Arl6IP1或HA-VAP-A和FLAG-野生型PEX19（FLAG-PEX19 WT），并以与(A类)同样计算HA-Arl6IP1或HA-VAP-A弥漫定位的细胞数量。误差条代表三个独立实验的SD。双星号表示统计显著性（学生t吨测试**第页 < 0.01).

图4
在MG132存在下，PEX19敲除导致内源性网织红蛋白3的细胞质聚集。用靶向PEX19或对照siRNA的siRNA转染HeLa细胞，并在蛋白酶体抑制剂MG132存在下培养，然后用抗Rtn3 pAb和抗PDI mAb进行免疫染色。方框区域表示提示内源性Rtn3细胞质聚集的点状免疫反应信号。棒材，20 微米。

图5
PEX3参与Arl6IP1翻译后靶向ER膜。用靶向PEX3或PEX19或对照siRNA的siRNA转染HeLa细胞，半透性，并用*在体外*用3xFLAG-Arl6IP1进行翻译后靶向分析，如图1所示。箭头表示通过3xFLAG-Arl6IP1与PDI共定位判断的内质网翻译后靶向性。棒材，20 微米。

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1. Keenan RJ、Freymann DM、Stroud RM、Walter P.《信号识别粒子》。每年。生物化学评论。2001;70:755–775. doi:10.1146/annurev.biochem.70.1.755。-内政部-公共医学

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[9] Keenan RJ、Freymann DM、Stroud RM、Walter P.《信号识别粒子》。每年。生物化学评论。2001;70:755–775. doi:10.1146/annurev.biochem.70.1.755。-内政部-公共医学

[10] Keenan RJ、Freymann DM、Stroud RM、Walter P.《信号识别粒子》。每年。生物化学评论。2001;70:755–775. doi:10.1146/annurev.biochem.70.1.755。-内政部-公共医学

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