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.2018年2月2日；8(1):2211.
doi:10.1038/s41598-018-20489-9。

睫状体病变蛋白TALPID3/KIAA0586在斑马鱼光感受器外段的形成和维持中作用于Rab8激活的上游

艾琳·奥杰达·纳哈罗斯 1, 弗拉维亚·B·克里斯蒂安 1 2, 京京藏 1, 马蒂亚斯·盖塞曼 1, 菲利普·英格姆 三, 史蒂芬·C·F·纽豪斯 1, 鲁珊德拉·巴赫曼·加格斯库 4 5
附属机构

睫状体病变蛋白TALPID3/KIAA0586在斑马鱼光感受器外段的形成和维持中作用于Rab8激活的上游

艾琳·奥杰达·纳哈罗斯等。 科学代表. .

勘误表in

摘要

纤毛病是由初级纤毛功能障碍引起的人类疾病，初级纤毛是信号转导中普遍存在的基于微管的细胞器。纤毛通过基底体（BBs）固定在细胞内，修饰的中心粒也充当微管组织中心。光受体（PR）是感觉神经元，其初级纤毛形成一个高度专业化的隔室，称为外段（OS），负责感应入射光。因此，睫状体病变常伴有视网膜变性。KIAA0586/TALPID3（TA3）突变可导致Joubert综合征，其中30%的患者出现视网膜受累。为了阐明TALPID3在PRs中的功能，我们研究了TALPID3斑马鱼突变体，并确定了进行性视网膜变性表型。大多数PR缺乏OS开发，因为BB定位和在顶端细胞表面对接存在缺陷。光色素视蛋白的细胞内积累导致中度PR细胞死亡。视网膜电图显示严重的视觉损伤。一小部分PR通过母体存放的Talpid3进行救援，显示通常停靠的BB和扩展的OS。虽然在BB对接中起重要作用的小GTPase Rab8a的定位在talpid3-/-PR中似乎未受影响，但组成活性Rab8a-的过度表达可拯救OS的形成，表明Ta3在早期纤毛发生中的作用位于PR中Rab8a激活的上游。

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数字

图1
图1
Ta3定位于感光细胞初级纤毛的母子中心粒，在合子中大部分缺失ta3型突变PRs。(A–A“)用抗乙酰化微管蛋白染色标记新生纤毛（绿色）和用抗Ta3（红色）染色的3dpf视网膜冰冻切片显示Talpid3定位在野生型（wt）幼虫PR纤毛的底部。双箭头突出了Ta3在母子中心粒的定位。(B–B“)在3 dpf冷冻切片中ta3−/−幼虫，Ta3信号大部分被消除（空箭头(B“))，但孤立的BB仍有正的Ta3信号，可能是母体沉积的（箭头位于(B“)). 中的装箱区域(A–B“)显示为每个相应面板左下角的插图。ONL外核层，OS外节，S突触。比例尺：2.5 µm英寸(A类–B”), 1 英寸。
图2
图2
t吨a3类突变体表现为进行性视网膜变性和细胞内视蛋白积聚。(A类,B类)视网膜分层不受影响ta3型在4dpf冷冻切片上看到的突变体，用亲脂染料BODIPY（红色）染色以标记细胞膜和外段，用DAPI（蓝色）标记细胞核。请注意，带有操作系统的PR数量减少，并且单元格形状发生了变化ta3型与野生型相比的突变体（wt）(A’–B’). (C、 D类)用识别视紫红质和红绿色视锥蛋白的4D2抗体（绿色）染色的4dpf冰冻切片上有明显的细胞内视紫红蛋白积累。细胞核用DAPI复染。(E类,F类)wt PR细胞层的高倍图像(E类)以及ta3型突变体(F类)4dpf冷冻切片用4D2抗体染色（绿色E、 F类)和BODIPY（红色E、 F类)突出显示操作系统。注意突变PRs中大量的细胞内视蛋白积累(F类)（箭头）。(G公司)PR细胞的渐进性死亡ta3型通过TUNEL分析评估突变体。注意，4 dpf中TUNEL阳性细胞的数量明显较少ta3−/−幼虫在黑暗中长大（深红色倒三角形），而在正常光照周期中长大（浅红色三角形）。通过眼睛的等效区域对全视网膜冰冻切片中相同厚度的共焦叠加进行量化。每个数据点表示在单个幼虫中计数的TUNEL阳性细胞核的数量***第页 < 0.001, ****第页 < 0.0001，学生t吨-测试。条形图表示标准偏差。(H（H）)整体ta3−/−眼部冰冻切片用TUNEL法（红色）和4D2抗体（绿色）染色。箭头标记TUNEL阳性PR。(我)高倍放大的PR图像，视蛋白定位严重错误（4D2，绿色），TUNEL反应阳性（红色，箭头）。数字功率因数受精后天数，GCL公司颗粒细胞层，印度卢比内核层，IPL公司内网状层，n个数字，NS公司不重要，在线外核层，OPL公司外丛状层，操作系统外段，公共关系光感受器，S公司突触，重量野生型。比例尺：30 µm英寸(A类,B类)和H，4 µm英寸(A’–B’), (E类,F类)而我，40岁 µm英寸(C类,D类).
图3
图3
Ta3缺失导致视觉功能丧失。(A类)野生型（WT，蓝色曲线）和ta3型突变型（红色曲线）6dpf幼虫暴露在7000勒克斯（明亮光强度）的光刺激下。(B类)WT（蓝色三角形）和钽3变种（红圈）(n个 = 18ta3型突变动物和10只野生型动物）。条形图表示标准偏差****第页 < 0.0001，学生t吨-测试，n个 = 野生型幼虫10只，突变型幼虫18只。
图4
图4
操作系统开发不足ta3−/−大多数PR中的幼虫。(A类,B类)用DiO染色的3dpf冰冻切片标记OS（绿色，箭头），用VDAC1标记线粒体簇，显示OS数量减少ta3型突变体(B类)与野生型（wt）相比(A类). 星号突出突变体中没有OS的PR。细胞核用DAPI（蓝色）复染。(C类)量化具有扩展OS的PR的比例（wt）（黑色三角形）与ta3型突变体（灰色方块）显示突变体中含有OS的PR显著降低(****第页 < 0.0001，t检验，n = 12 wt和12个突变幼虫）。每个数据点表示单个幼虫的单个共焦切片上PRs与OS的比例。条形图是标准偏差。(D类)冷冻切片上平均OS长度的量化显示，3 dpf wt和ta3型突变体(第页 = 0.7366，学生的t吨-测试，n个 = 12 wt和12个突变幼虫）。每个数据点表示单个幼虫的单个共焦截面上的平均OS长度。误差线是标准偏差。(E–G’)3 dpf wt的典型透射电子显微镜图像(E–E’)以及钽3突变体(F–G’)视网膜。(E–E’)大多数wt PR都扩展了操作系统（括号为E类)或开始堆叠薄膜（白色箭头E’). 注意BB（中的箭头E’)和连接纤毛（内的空箭头E’)在wt光感受器中。(F–F’)相比之下ta3−/−PR，只有少数PR扩展了OS（括号为F类)，在其他PR中未观察到膜堆积的尝试(F’). (G公司)注意突变体中延伸的OS的正常外观，包括结构正常的连接纤毛（箭头在G’)和基体（箭头所示G’). 一vg（vg）平均值，数字功率因数受精后天数，是内段，米线粒体，N个核，NS公司不重要，在线外核层，操作系统外段，公共关系光感受器，S公司突触，重量野生型。比例尺：4 µm英寸(A类,B类), 3 E和F中的µm，0.5 µm英寸(E’), 2 µm英寸(G公司), 1 µm英寸(F英尺–G’).
图5
图5
中的BB定位异常ta3−/−PR是OS开发缺陷的基础。(A类,B类)用BODIPY（红色）标记OS和线粒体簇的膜和用抗Centrin抗体（绿色）标记基体染色的4dpf冷冻切片显示BB在线粒体下方的异常定位ta3−/−公关。在野生型（wt）PR中，中心标记为BB（中箭头A’)位于OS（直支架）的底部和线粒体簇（弯曲支架）的顶部，而这种定位在大量的ta3型BBs位于线粒体簇下方的突变PRs（箭头所示B’). (C类,D类)用抗VDAC1抗体（红色）在4dpf冰冻切片上进行免疫荧光标记线粒体，用抗中心蛋白抗体标记BB，显示BB在ta3型线粒体基底突变体（箭头所示D类)与重量相比(C类). (E类)基于抗中心蛋白抗体的免疫荧光定量BB相对于线粒体簇的位置。每个数据点代表单个幼虫的整个视网膜共聚焦截面上BB低于线粒体簇下1/3的PR的比例。线粒体簇下方异常BB定位的4dpf PRs比例在ta3型突变体(****第页 < 0.0001，学生t吨-测试，n个 = 10个野生型和9个突变幼虫）。条形图是标准偏差。(F–F“)典型的TEM图像显示，即使在5 dpf的后期，当所有BB都应该停靠在心尖膜上时，线粒体簇内的横截面（箭头）中也存在BB。(F’)装箱区在吗(F类)和(F“)装箱区在吗(F’).BB公司基体，是内段，米线粒体，N个核，在线外核层，操作系统外部段，公共关系光感受器。比例尺：10 µm英寸(A类,B类), 3 µm英寸(A’–B’), 4 µm英寸(C类,D类), 3 µm英寸(F类), 1 µm英寸(F’)和0.5 µm英寸(F“).
图6
图6
外段开发由积极主动的Rab8a拯救。(A–A“)4 dpf wt幼虫在锥体PRs中瞬时表达wt-mCherry-tagged Rab8a的冷冻切片(tacp:mCherry-Rab8aWT）用DiO复染以标记细胞核的OS（绿色）和DAPI。注意，Rab8a的点状表达模式集中在内段空间（箭头）。(B–B“)当将该转基因表达于ta3−/−PR（箭头）。(C–C“)mCherry-tagged Rab8a组成活性形式的表达(tacp:mCherry-Rab8aCA）以wt锥PR为单位。(D–D“)ta3−/−表达组织学活性Rab8a的PRs发展为OS（D中的箭头“）。(E类)4 dpf比例的量化ta3型突变体PRs表达含有OS的组成活性Rab8a（红圈），钽3表达野生型Rab8a和OS的突变PRs（绿色方块）或ta3型没有用OS表达转基因Rab8a的突变体PR（黑色三角形）。只有组成活性形式的Rab8a在ta3型突变体(****第页 < 0.0001，NS不显著，学生t吨-测试，n个 > 20只幼虫表达转基因和13只非转基因幼虫）。每个数据点代表一个单独的幼虫。条形图是标准偏差。在线外核层，操作系统外段，S公司突触。比例尺：3 所有面板均为µm。
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