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.2018年4月；12(4):476-494.
doi:10.1002/1878-0261.12176。 Epub 2018年2月20日。

激活TNF-α/NF-κB轴增强CRL4BDCAF公司11E3连接酶活性与人骨肉瘤细胞的细胞周期调控

张彩国 1 2, 陈斌（Bin Chen） 1, 蒋凯标 1, 李丰老挝 1, 沈红星 1, Zhi Chen先生 1
附属公司

激活TNF-α/NF-κB轴增强CRL4BDCAF公司11E3连接酶活性与人骨肉瘤细胞的细胞周期调控

张彩国等。 Mol Oncol公司. 2018年4月.

摘要

Cullin 4B是Cullins家族的一员，是促进E3连接酶复合物组装的支架，在许多癌症中异常表达，包括骨肉瘤。最近，我们观察到CUL4B形成CRL4BDCAF公司11E3连接酶，特异性泛素化并降解细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂p21Cip1号机组在人骨肉瘤细胞中。然而，有关CUL4B异常表达和该信号通路上游成员的潜在机制大多尚不清楚。在这项研究中，我们证明了核因子κB（NF-κB）是CUL4B表达的直接调节剂。CUL4B启动子对几个NF-κB亚基有反应，包括RelA、RelB和c-Rel，但对p50或p52没有反应。其他研究表明，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）/NF-κB轴通路在人骨肉瘤细胞中被激活。这种激活导致CUL4B和NF-κB亚单位在人骨肉瘤细胞核中大量存在。单个基因的下调，包括TNFR1、RelA、RelB、c-Rel和CUL4B，或其中的成对基因的下调（包括TNFR1+RelA，TNFR1+RelB，TNFR1+c-Rel，和RelA+CUL4B），对细胞生长抑制、集落形成、细胞侵袭和体内肿瘤形成具有类似的影响，而CUL4B在这些敲除细胞中的过度表达显著逆转了它们的表型。TNF-α/NF-κB通路的抑制大大减弱了CRL4BDCAF公司11E3连接酶活性并导致p21的积累Cip1号机组从而导致细胞周期停滞在S期。总之，我们的结果支持一个模型，即TNF-α/NF-κB轴的激活有助于CRL4B的增加DCAF公司11p21的活性和减少Cip1号机组蛋白质水平，从而控制人类骨肉瘤细胞的细胞周期进展。

关键词：CRL4B E3连接酶；核因子-κB；肿瘤坏死因子-α；骨肉瘤；p21Cip1；无处不在。

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数字

图1
图1
法国试验标准κB调节下次再会4B在人骨肉瘤细胞中的表达。（A） Cullin基因启动子示意图。的启动子区域（-1至-1500）下次再会1,死胡同2,下次再会三,下次再会4A级,下次再会4B类,下次再会5、和死胡同7指示，并且法国试验标准κB结合位点下次再会4B类启动子用蓝色表示。（B） 共识法国试验标准κB结合位点序列下次再会4B类发起人。共识序列法国试验标准中的κB下次再会4B类启动子显示为蓝色pGL公司4.26‐ 对下次再会 4B类 ‐荧光素酶并指出其突变版本。（C‐D）荧光素酶分析。U2乐队操作系统细胞表达pCDNA基因3‐RelA‐标志,pCDNA基因3‐RelB‐标志,pCDNA基因3‐c‐Rel‐标志,pCDNA基因3‐p50‐标志、和pCDNA基因3‐p52‐标志与萤火虫荧光素酶报告载体共转染pGL公司4.26‐ 对下次再会 4B‐ 重量 ‐吕克或pGL公司4.26‐ 对下次再会 4B‐突变体 ‐吕克和Renilla荧光素酶载体pRL公司‐TK公司在37°C下培养24小时后，使用双荧光素酶报告分析系统对细胞进行荧光素酶分析。（E‐G）通道IP（IP）化验。U2乐队操作系统下调的电池RelA公司,RelB公司,c‐相对,第50页，或第52页受到ChIP（IP）使用特定抗体进行检测，并通过以下方法测量与Cullin基因的结合qRT（定量放射治疗）‐聚合酶链反应.每一项的丰富性卡林对照对照载体对基因进行标准化**P（P）< 0.001.
图2
图2
RelA公司,RelB公司、和c‐相对在人骨肉瘤细胞中上调。（A） 的表达式法国试验标准骨肉瘤细胞中的κB亚单位。这个信使核糖核酸的级别RelA公司,RelB公司,c‐相对,第50页,第52页、和下次再会4B类在U2接受检查操作系统,MG公司第63页，Saos‐2，和HOS公司根据离岸价格1.19个电池**P（P）< 0.001. （B） 蛋白质水平法国试验标准骨肉瘤细胞中的κB亚单位。RelA、RelB、c‐Rel、p50、p52和死胡同4B在hFOB（离岸价格）1.19,HOB公司、Ho‐f、U2操作系统,MG公司63、Saos‐2和HOS公司细胞。GAPDH公司用作加载控制。（C） 蛋白质水平法国试验标准细胞质和细胞核中的κB亚单位。制备细胞的细胞裂解物（总）、细胞质和细胞核部分，并进行免疫印迹以检测RelA、RelB、c‐Rel、p50、p52和下次再会这三个部分的4B水平。β‐肌动蛋白和PARP项目作为对照，分别测定细胞质和核蛋白水平。
图3
图3
敲除RelA、RelB或c‐Rel抑制骨肉瘤细胞生长。（A） 击倒RelA公司,RelB公司，或c‐相对抑制骨肉瘤细胞增殖。U2乐队操作系统细胞转染Con‐sh核糖核酸（U2操作系统控制），RelA‐sh核糖核酸（U2操作系统‐相对A‐杜兰特)，雷尔B‐sh核糖核酸（U2操作系统‐相对B‐杜兰特)，c‐相对核糖核酸（U2操作系统‐c‐相对‐杜兰特)，相关信息核糖核酸 + pCDNA基因3‐下次再会4B（U2操作系统‐相对A‐杜兰特+下次再会4B），相对B‐sh核糖核酸+pCDNA基因3‐下次再会4B（U2操作系统‐相对B‐杜兰特 + 下次再会4B）或c‐Rel‐sh核糖核酸 + pCDNA基因3‐下次再会4B（U2操作系统‐c‐相对‐杜兰特 + 下次再会4B）。48小时孵育后，MTT公司在490nm处通过吸光度测量评估细胞增殖。用western blots（右侧）测量RelA、RelB和c‐Rel的敲除效率。1（U2操作系统‐控制），2（U2操作系统‐RelA、RelB或c‐Rel‐杜兰特)，3（U2操作系统‐RelA、RelB或c‐Rel‐杜兰特 + 下次再会4B）。（B） 击倒RelA公司,RelB公司、和c‐相对菌落形成率降低。将A中使用的细胞接种到12孔板上，并与0.1 mL含有0.5%的新鲜培养基一起培养FBS公司两周**P（P）< 0.001（C）拆卸RelA公司,RelB公司、和c‐相对细胞侵袭减少。对A中使用的细胞进行Boyden小室分析，并对侵入细胞进行计数（右侧面板）**P（P）< 0.001. 棒材=100μm。（D） 击倒RelA公司,RelB公司、和c‐相对减少了体内肿瘤形成能力。将A中使用的细胞经皮注射到小鼠两侧。每隔5天用细卡尺测量肿瘤体积。
图4
图4
TNF公司‐α/法国试验标准人骨肉瘤细胞激活了κB轴。（A） 关键成员的蛋白质水平TNF公司‐α/法国试验标准κB轴。蛋白质水平TNFR公司1,贸易,安息,TRAF公司2,IKK公司，IκBα，磷酸化IκB-α(等电点κBα）、RelA、RelB、c‐Rel、p50、p52和下次再会4B在hFOB（离岸价格）1.19，U2操作系统,MG公司第63页，Saos‐2，和HOS公司细胞。GAPDH公司用作加载控制。（B） 的影响电涌保护器304关于TNF公司‐α/法国试验标准κB轴构件。离岸价格1.19，U2操作系统,MG公司第63页，Saos‐2，和HOS公司用电涌保护器304持续24小时，然后用免疫印迹法测定（A）中指示的蛋白质水平。（C） 击倒的影响KNFR公司1的蛋白质水平TNF公司‐α/法国试验标准κB轴构件。hFOB（离岸价格）1.19，U2操作系统和Saos‐2细胞转染TNFR公司第1页核糖核酸，并对稳定的细胞系进行免疫印迹测定TNF公司‐α/法国试验标准κB轴成员蛋白水平。
图5
图5
破坏TNF公司‐α/法国试验标准κB轴减弱p21的泛素化。（A） p21在骨肉瘤细胞中表达下调。p21蛋白水平hFOB（离岸价格）1.19，U2操作系统,MG公司第63页，Saos‐2，和HOS公司细胞测定。下次再会4B、，CDK公司2，以及GAPDH公司用作对照。（B） 的影响电涌保护器p21蛋白水平304。U2乐队操作系统用（+）或不用（-）处理Saos‐2细胞电涌保护器304持续24小时死胡同4B，第21页，CDK公司2，以及GAPDH公司已确定。（C） 中断的影响TNF公司‐α/法国试验标准κB轴对p21蛋白水平的影响。U2乐队操作系统用处理的细胞电涌保护器304或U2操作系统转染细胞TNFR公司第1页核糖核酸,TNFR公司第1页核糖核酸+相对A‐si核糖核酸,TNFR公司第1页核糖核酸+相对B‐si核糖核酸,TNFR公司第1页核糖核酸+c‐相对核糖核酸,下次再会4亿英镑核糖核酸，或下次再会4亿英镑核糖核酸+相对A‐si核糖核酸评估了下次再会4B，第21页，CDK公司2，以及GAPDH公司（D–E）TNF公司‐α/法国试验标准κB轴对p21泛素化的破坏。U2乐队操作系统细胞；U2乐队操作系统被击倒的细胞TNFR公司1、RelA、RelB、c‐Rel、，下次再会4B、，TNFR公司1+RelA，TNFR公司1+RelB，TNFR公司1+c‐Rel或RelA+下次再会4B中；和U2操作系统用处理的细胞电涌保护器共转染304个pCDNA基因3‐p21‐标志和哈‐泛素48小时；细胞被裂解，用Flag抗体免疫沉淀，并用抗哈检测泛素化p21的抗体。p21‐Flag的输入通过使用抗Flag抗体的western blotting测定。
图6
图6
的阻塞TNF公司‐α/法国试验标准κB轴抑制骨肉瘤细胞生长。（A） 堵塞TNF公司‐α/法国试验标准κB轴减少TNFR公司1、RelA、RelB、c‐Rel和下次再会4B级。U2乐队操作系统转染con-sh的细胞核糖核酸（a） ，U2操作系统‐TNFR公司1‐杜兰特+相对A‐杜兰特（b） ，U2操作系统‐TNFR公司1‐杜兰特+相对B‐杜兰特（c） ，U2操作系统‐TNFR公司1‐杜兰特+c‐相对A‐杜兰特（d） ，U2操作系统‐电涌保护器304（e），U2操作系统‐TNFR公司1‐杜兰特（f） ，U2操作系统‐相对A‐杜兰特 + 下次再会4B‐杜兰特（g） ，U2操作系统‐下次再会4B‐杜兰特（h） ，U2操作系统‐TNFR公司1‐杜兰特+下次再会4B（i），U2操作系统‐电涌保护器304 + 下次再会4B（j），U2操作系统‐TNFR公司1‐杜兰特+相对A‐杜兰特 + 下次再会4B（k），U2操作系统‐TNFR公司1‐杜兰特+相对B‐杜兰特 + 下次再会4B（l）和U2操作系统‐TNFR公司1‐杜兰特+c‐相对杜兰特 + 下次再会4B（m）进行western blots检测TNFR公司1、RelA、RelB、c‐Rel和下次再会4B、。GAPDH公司用作加载控件。（B） 堵塞TNF公司‐α/法国试验标准κB轴抑制骨肉瘤细胞增殖。（A）中使用的细胞使用MTT公司在490nm处通过吸光度测量评估细胞增殖。（C） 堵塞TNF公司‐α/法国试验标准κB轴降低了菌落形成率。将来自A的细胞接种到12孔板上，并用0.1 mL含有0.5%的新鲜培养基培养FBS公司两周**P（P）< 0.001. （D） 堵塞TNF公司‐α/法国试验标准κB轴减少细胞侵袭。对来自A的细胞进行Boyden室测定，并对侵入性细胞进行计数**P（P）< 0.001. （E） 堵塞TNF公司‐α/法国试验标准κB轴减少了体内肿瘤形成能力。将A细胞皮内注射到小鼠两侧。每隔5天用细卡尺测量肿瘤体积。
图7
图7
破坏TNF公司‐α/法国试验标准κB轴导致S期细胞周期阻滞。U2乐队操作系统转染Con-sh的细胞核糖核酸（控制）（A），U2操作系统‐电涌保护器304（B），U2操作系统‐TNFR公司1‐杜兰特 (C类)，U2操作系统‐相对A‐杜兰特+相对A‐杜兰特（D） ，U2操作系统‐TNFR公司1‐杜兰特+相对B‐杜兰特（E） ，U2操作系统‐TNFR公司1‐杜兰特+c‐相关杜兰特（F） ，U2操作系统‐下次再会4B‐杜兰特（G） ，U2操作系统版本A杜兰特 + 下次再会4B‐杜兰特（H） ，或U2操作系统p21蛋白石油当量（一） 进行流式细胞术分析以确定细胞周期分布。在（J）中量化了从A到I的细胞周期分布。
图8
图8
的示意图TNF公司‐α/法国试验标准‐κB/下次再会人骨肉瘤细胞中的4B/p21轴。激活TNF公司α信号促进TNFR公司具有贸易，招募哪些人TRAF公司2和安息.TRAF公司2名新员工IKK公司，通过以下方式启用其激活安息.激活的IKK公司磷酸化IκBα并导致IκB-α降解，从而减弱其对法国试验标准κB并导致法国试验标准κB水平。累计法国试验标准细胞质中的κB随后转移到细胞核并诱导转录下次再会4B类.过度表达下次再会4B作为支架，与迪拜国际机场1,苏格兰皇家银行1，和DCAF公司11以形成CRL公司4B E3连接酶。这个CRL公司4B E3连接酶促进泛素从苏格兰皇家银行骨肉瘤细胞中E2与p21结合。泛素化p21的降解消除了其对CDK公司从而干扰细胞周期的进展。
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