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.2018年2月1日；554(7690):128-132.
doi:10.1038/nature25460。 Epub 2018年1月24日。

线粒体翻译需要叶酸依赖性tRNA甲基化

拉斐尔·莫舍尔 1 2, 格雷戈里·杜克 1 2, 索菲娅·辛钟丽 三, 约翰内斯·梅耶尔 4, 泽梅尔·吉泰 三, 沃尔夫冈·斯佩尔 4, 约书亚·D·拉比诺维茨 1 2
附属公司

线粒体翻译需要叶酸依赖的tRNA甲基化

拉斐尔·莫舍尔等。 自然. .

摘要

叶酸能够激活和转移嘌呤、胸苷和甲硫氨酸生物合成的单碳单元。抗叶酸是重要的免疫抑制剂和抗癌药物。在增殖性淋巴细胞和人类癌症中，线粒体叶酸酶的上调尤为强烈。这在一定程度上反映了线粒体需要生成一个碳单位，并将其输出到细胞液中进行合成代谢。然而，线粒体室本身中叶酸结合单碳单位的全部用途尚未得到彻底探索。这里我们表明，线粒体叶酸酶丝氨酸羟甲基转移酶2（SHMT2）的催化活性丧失，而其他叶酸酶的催化活性没有丧失，导致线粒体翻译受损导致人类细胞中氧化磷酸化缺陷。我们发现SHMT2可能通过产生线粒体5,10-亚甲基四氢叶酸，提供甲基供体，在选择的线粒体tRNA的摆动位置产生牛磺酸甲基尿苷碱。SHMT2基因敲除人类细胞中的线粒体核糖体谱分析表明，缺少这种修饰的碱基会导致翻译缺陷，线粒体优先核糖体在某些赖氨酸（AAG）和亮氨酸（UUG）密码子处停滞。这导致呼吸链酶的表达受损。在线粒体代谢的某些先天性错误中，也会发生这些特定密码子的停滞。叶酸缺乏或抗叶酸治疗导致全细胞叶酸代谢中断，也会损害呼吸链。总之，哺乳动物线粒体使用叶酸结合的单碳单位甲基化tRNA，这种修饰是线粒体翻译和氧化磷酸化所必需的。

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利益冲突声明

竞争性金融利益

作者声明没有相互竞争的经济利益。

数字

扩展数据图1
扩展数据图1。不同细胞背景和克隆中SHMT2缺失诱导的呼吸链功能障碍
一，细胞生长48小时后培养基颜色发生变化。b条、乳酸分泌和c（c），标准化NAD+/HCT116基因敲除细胞株的NADH比率(n个= 6).c（c）用Seahorse XF分析仪测定HEK293T叶酸1C基因CRISPR/Cas9敲除细胞系的基础呼吸(n个=3）和e（电子），标准化NAD+/NADH比率(n个= 3).（f）TCA循环和相关代谢物的标准化水平(n个= 3).克，从[U到柠檬酸盐的稳定状态标记分数-13C] -底物分别为谷氨酰胺和葡萄糖(n个= 3).小时、提取线粒体的呼吸链复合物I-V亚单位和线粒体质量标记的免疫印迹。我，独立HCT116叶酸1C基因敲除克隆中的线粒体复合物I水平（NDUFS4）。结果以平均值±s.e.m表示；n个表示生物复制的数量。重要性由双尾Student’s计算t吨-测试*P（P）<0.01（精确p值见补充表7）。缩写：CI-V，呼吸链复合体I-V。
扩展数据图2
扩展数据图2。催化缺陷SHMT2结构
一，使用iCn3D对人类SHMT1（PDB代码1BJ4）上的突变氨基酸残基进行定位，并对大肠杆菌丝氨酸羟甲基转移酶（GLYA）、智人线粒体丝氨酸羟甲基转移酶2（GLYM）和细胞溶质丝氨酸羟基甲基转移酶1（GLYC）进行比对。GLYM的位置参考GenBank NM_005412.5。b条，Sanger测序突变结构的痕迹。c（c），线粒体复合物I水平（NDUFS4）的免疫印迹，用于重新表达催化缺陷型SHMT2的细胞系。
扩展数据图3
扩展数据图3。恢复SHMT2催化活性对于使单碳通量、呼吸链表达、糖酵解活性和细胞生长正常化至关重要
一、催化活性SHMT2再表达的免疫印迹以及对线粒体复合物I和II水平的影响。b条-（f），在HEK293T背景中SHMT2催化活性和非活性形式再表达的影响。b条，标准化NAD+/NADH比率(n个= 6)c（c）乳酸分泌和葡萄糖摄取(n个= 6),d日，细胞增殖(n个= 6).e（电子），嘌呤生物合成中间产物5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸（AICAR）水平(n个=4）作为胞浆叶酸盐1C状态的指标，以及（f）, [2,3,3-2H] -丝氨酸追踪以区分细胞溶质和线粒体叶酸1C单位生成，并将其并入脱氧胸苷三磷酸(n个= 3). 结果以平均值±s.e.m表示；n个表示生物复制的数量。重要性由双尾Student’s计算t吨-测试*P（P）<0.01（精确p值见补充表7）。
扩展数据图4
扩展数据图4。氧化磷酸化缺陷是由不依赖蛋氨酸甲酰化的转录后机制引起的
一用高分辨率液相色谱质谱法（WT）测定线粒体表达的MTCO1肽的起始氨基酸（甲酰甲硫氨酸vs.蛋氨酸）的分数n个=4，ΔSHMT2n个=3，百万分之二n个= 2).b条，乳酸分泌(n个=3）补充肌氨酸（1 mM）。c（c），HEK293T中的相对mtDNA水平(n个= 3).d日HCT116和HEK293T敲除细胞株mtDNA长程PCR产物的琼脂糖凝胶。e（电子）线粒体DNA编码呼吸链亚单位的相对mRNA水平(n个= 3).（f），通过总RNA测序比较SHMT2基因敲除细胞系与SHMT2野生型重表达细胞系的基因表达水平。每个点代表从两个独立的敲除克隆和匹配的重表达系的两个生物复制中获得的平均基因表达(n个= 4). 与人类OXPHOS功能相关的基因以红色突出显示。显著差异表达的基因列于补充表2中。克，HEK293T野生型、SHMT2敲除和MTHFD2敲除细胞系中mtDNA的位置依赖性下一代测序覆盖率支持由于SHMT2缺失而不存在缺失。小时，对应的变量位置和频率。变量列表见补充表1。条形图显示平均值±s.e.m；n个表示生物复制的数量。重要性由双尾Student’s计算t吨-测试*P（P）<0.01（精确p值见补充表7）。缩写：线粒体DNA。
扩展数据图5
扩展数据图5。SHMT2缺失导致线粒体翻译受损
一，SDS-PAGE共页[35S] -蛋氨酸标记的野生型（1区）和两个SHMT2基因敲除的HEK293T细胞系（2、3区）线粒体翻译蛋白。COX1和COX2/3的合成减少在短时间暴露下明显，ND5和ND6的合成减少更容易在长时间暴露下看到。b条，微球菌核酸酶消化的细胞裂解物蔗糖梯度分馏后254 nm处的吸光度（图3a）。如线粒体核糖体亚基MRPL11的匹配免疫印迹所示，收集与4和5相对应的组分进行线粒体核糖体富集。c（c），13个线粒体蛋白编码转录物的读取长度分布（顶部）和读取长度依赖性亚密码子读取阶段（底部）。面板c基于正文图3中显示的线粒体核糖体剖析实验的数据，并显示了两个独立样本的两个技术复制品的平均值。
扩展数据图6
扩展数据图6。线粒体核糖体在鸟苷末端分裂密码子盒核苷酸三联体处停滞表明5-牛磺酸甲基尿苷修饰不足
一，主要文本的扩展版本，图3b，在本例中显示了所有线粒体蛋白编码基因的平均累积核糖体保护片段。b条，线粒体转录物积极翻译（即未停滞）核糖体的平均相对密度。一和b条，两个独立样本的两个技术副本。c（c）、柠檬酸合成酶的酶活性和线粒体提取物的单个线粒体呼吸链复合物（n=5）。条形图显示平均值±标准误差。显著性由双尾学生的t吨-测试*P（P）<0.01（精确p值见补充表7）。d日，线粒体遗传密码表，带有分裂的密码盒，取决于牛磺酸甲基化tRNA的翻译，以红色突出显示。由含有甲酰胞苷的反密码子tRNA解码的密码子大都会以蓝色突出显示。e（电子），补充肌氨酸（1 mM）的HCT116 SHMT2/MTHFD2双敲除细胞系的平均密码子特异性线粒体核糖体占有率。红色突出显示的密码子由携带5-牛磺酸甲基尿苷修饰的tRNA解码。补充肌氨酸可防止SHMT2缺失时正常观察到的失速（n=2）。
扩展数据图7
扩展数据图7。ΔSHMT2中tRNA修饰状态及人类疾病基因引起5-牛磺酸甲基尿苷修饰缺失的影响MTO1公司
一，SHMT2缺失后消化线粒体tRNA中5-甲酰胞苷一磷酸的总离子色谱图。对相同样品进行了图4b中5-牛磺酸甲基尿苷一磷酸（tm5U）的分析。综合数据表明，SHMT2缺失导致tm5U丢失，但不会导致5-甲酰胞苷丢失。b条野生型HCT116和SHMT2缺失系中tm5U、5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷单磷酸（tm5s2U）和2-硫代尿嘧啶单磷酸（s2U）的水平归一化为5-甲酰胞苷单磷酸(n个= 3).c（c），HCT116野生型和SHMT2敲除细胞系中的牛磺酸水平(n个= 3).d日SHMT2再表达后消化线粒体tRNA中的tm5U水平(n个= 1).e（电子）在补充肌氨酸后HCT116 SHMT2/MTHFD2敲除株系中，tm5U、tm5s2U和s2U水平归一化为f5C，在MTO1缺失时HCT116(n个= 2). 对于所有面板，数据仅表示为平均值±标准偏差或单个数据点。（f），在含有[3-13C] -丝氨酸或[U-13C] -蛋氨酸。克，HCT116 MTO1基因敲除细胞系中核糖体分析后映射到线粒体蛋白质编码转录物的核糖体保护片段（RPF）的平均累积计数。数据被标准化为每百万读（RPM）(n个= 2);n个表示生物复制的数量。重要性由双尾Student’s计算t吨-测试*P（P）<0.01（精确p值见补充表7）。
扩展数据图8
扩展数据图8。线粒体核糖体停滞位点的mRNA和蛋白质二级结构效应研究
一，根据Rouskin S.等人发布的硫酸二甲酯测序数据集中的线粒体转录数据分析，确定线粒体RNA二级结构。计算R值和基尼差异，以检测两个基因之间核苷酸反应性的变化体内完整线粒体转录组的变性条件。彩色点表示补充表4中给出的结构化区域。b条，HCT116 SHMT2敲除细胞系核糖体停滞位点的测定。数据点代表所有13个线粒体蛋白编码转录本的单个密码子。对于每个密码子，y轴表示以百万读数（RPM）标准化为基因-中点的核糖体计数。x轴表示SHMT2剔除中的归一化计数与野生型HCT116中的归一化计数的比率。灰色和黑色虚线分别表示基因组中所有密码子平均值以上的两个和三个标准差（SD）。以红色突出显示的是>2 SD的密码子。c（c），从SHMT2敲除特异性核糖体停滞位点（>3 SD）对蛋白质结构进行AAG/UUG密码子的定位。对于b条和c（c），分析基于核糖体剖面数据，如正文图3所示，两个独立样本的两个技术复制。已识别密码子和已绘制的AAG/UUG位点列表见补充表5。
扩展数据图9
扩展数据图9。个体患者系核糖体分析中的线粒体转录密码子占有率
一，个体患者衍生细胞系中密码子特异性线粒体核糖体占有率（患者/对照成纤维细胞）（每个个体患者n=1，标准化为n=2个对照成纤维纤维细胞系的平均值）。患者要么有核MTO1公司错义突变（pat_a c.[1261-5T>G]；[1430G>a]，pat_b c.[1222T>a]；[1222T>a]）或被诊断为MELAS并携带tRNA Leu1线粒体基因中的重复点突变m.3243A>G(MT-TL1型).b条，mtDNA突变负载的下一代测序m.3243A>G(MT-TL1）在对照组成纤维细胞和MELAS患者细胞系中。每个条形图显示对照细胞系和患者细胞系的一个生物复制。集成基因组学查看器测序原始数据显示在右侧。
扩展数据图10
扩展数据图10。靶向单碳代谢对线粒体功能的影响
一在没有叶酸的情况下生长5代或在有指示的甲氨蝶呤浓度的情况下生存96小时后，免疫印迹上的线粒体复合物I和II水平被用作阳性对照。b条、叶酸消耗（使用或不使用次黄嘌呤和胸腺嘧啶作为救援剂）或甲氨蝶呤存在96小时后HCT116细胞中的细胞mtDNA水平(n个= 3).c（c），为了确定甲氨蝶呤引起的呼吸减少是否是由于甲氨喋呤消耗线粒体DNA、损害线粒体翻译或两者结合所致，我们比较了甲氨蝶啶（50 nM）和溴化乙锭（250 nM=100 ng/ml）在HCT116细胞中的作用，后者通常用于消耗线粒体DNA，以及氯霉素（310μM=100μg/ml），这会阻碍线粒体翻译。治疗48小时后，甲氨蝶呤和溴化乙锭均降低了耗氧量和DNA含量。重要的是，尽管溴化乙锭会更强烈地消耗线粒体DNA，但甲氨蝶呤对耗氧量的影响与甲氨蝶啶对耗氧量的影响相当，这部分是通过线粒体翻译抑制实现的。将数据标准化并与未经处理的对照组（所有n个= 3; 甲氨蝶呤96小时耗氧量除外n个=6和控制n个=4). 数据报告为平均值±标准误差；n个表示生物复制的数量。重要性由双尾Student’s计算t吨-测试*P（P）<0.01（精确的p值见补充表7），缩写：H/T，次黄嘌呤（100μM）/胸腺嘧啶（16μM）；Mtx公司。，甲氨蝶呤。
图1
图1。线粒体呼吸链功能依赖于SHMT2催化活性
一1C通路和已知线粒体产物。b条HCT116敲除细胞系的乳酸分泌(n个= 6).c（c），Seahorse XF分析仪测得的耗氧量(n个= 3).d日线粒体呼吸复合物I和II蛋白（NDUFS4和SDHA）、1C酶和线粒体质量（VDAC1）的免疫印迹。e（电子），基础呼吸(n个=3）在HEK293T敲除细胞系中重新表达野生型或催化缺陷型SHMT2突变形式。结果以平均值±s.e.m表示；n个表示生物复制的数量，对于海马实验来说，这是指在不同的日子里的独立平板。显著性由双尾学生计算t吨-测试*P（P）<0.01（精确p值见补充表7）。缩写：亚甲基-THF，5,10-亚甲基-TTF；甲酰四氢呋喃、10-甲酰四氟呋喃；四氢叶酸；dTTP，脱氧胸苷三磷酸；f-Met，n-甲酰甲硫氨酸；低聚物。，寡霉素；腐蚀/抗蚀。，鱼藤酮/抗霉素；类别。无效。，催化活性SHMT2；PLP结合缺陷型SHMT2。
图2
图2。ΔSHMT2诱导的呼吸链缺陷是由线粒体5,10-亚甲基-THF耗竭引起的，但与dTTP合成无关
一，肌氨酸是线粒体亚甲基-THF的SHMT2非依赖性来源。b条，北美+/NADH比率(n个与野生型相比，补充肌氨酸（1 mM）后SHMT2单一和SHMT2/MTHFD2双敲除细胞系中NDUFS4（复合物I）蛋白的表达。c（c）和d日，线粒体dTTP状态的功能读数基于c（c），mtDNA水平(n个=三)通过定量实时PCR和d日SHMT2基因敲除和野生型HEK293T细胞中的基因表达。对于d日，每个数据点代表两个独立敲除克隆的两个生物复制的平均基因表达(n个=4）和两个野生型复制(n个= 2). 与OXPHOS功能相关的基因以红色（核编码）或蓝色（线粒体编码）突出显示。补充表2中列出了显著差异表达的基因。条形图显示平均值±s.e.m；n个表示独立生物复制的数量。重要性由双尾Student’s计算t吨-测试*P（P）<0.01（精确p值见补充表7）。缩写：dTTP，脱氧胸苷三磷酸；线粒体DNA；RPKM，每千字节读取数/百万映射读取数。
图3
图3。线粒体核糖体图谱显示ΔSHMT2细胞缺乏翻译特定鸟苷末端密码子
一线粒体核糖体分析的工作流程：用氯霉素停止翻译并浸入液氮中，用微球菌核酸酶（MNase）裂解细胞并消化RNA。在蔗糖颗粒富集线粒体核糖体（红色阴影）后，对受保护片段进行测序。b条，沿选定线粒体转录物的平均累积核糖体密度。黑色为野生型HCT116，红色为ΔSHMT2。扩展数据图6a中给出了其他成绩单。c（c），平均密码子特异线粒体核糖体占有率（HCT116ΔSHMT2/HCT116型重量;). 以红色突出显示的数据点对应于携带5-牛磺酸甲基尿苷修饰的tRNA解码的密码子。以红色突出显示的文本标签对应于以鸟苷结尾的密码子子集，因此需要摆动碱基配对。蛋氨酸密码子以蓝色突出显示，没有显示密码子占用增加。插入物显示了相对于UUG和AAG密码子位置的平均归一化核糖体密度。b条和c（c），两个独立样本的两个技术副本。缩写：RPF，核糖体保护片段；RPM，每百万映射读取数。
图4
图4。MTO1/GTPBP3依赖的tRNA甲基化需要线粒体5,10-亚甲基-THF
一tRNA 34位反密码环修饰碱基与信使RNA密码子三位A/G相互作用，形成非Watson-Crick碱基对。b条，消化线粒体tRNAs的5-牛磺酸甲基尿苷一磷酸总离子色谱图（m/z=460.043）。5-甲酰胞苷一磷酸没有改变（扩展数据图7a）。c（c）HCT116 MTO1基因敲除细胞系和原发性患者源性成纤维细胞携带密码子的线粒体核糖体平均占有率MTO1公司突变或MT-TL1型m.3243A>G MELAS变体(n个= 2). 相应的免疫印迹如下所示。单个患者数据如图9a所示。d日，使用Seahorse XF分析仪测量的基础呼吸率。在没有叶酸的情况下生长5代或在有指定甲氨蝶呤浓度的情况下96小时后收集数据(n个=3，HCT116_WT除外n个=4和Mtx 50 nMn个= 6). 图表显示平均值±s.e.m；n个表示生物复制的数量。重要性由双尾Student’s计算t吨-测试*P（P）<0.01（具体p值见补充表7）。缩写：Mtx，甲氨蝶呤；H/T，次黄嘌呤（100μM）/胸苷（16μM）。
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