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比较研究
.2018年3月9日；293(10):3758-3769.
doi:10.1074/jbc。RA117.000295。 Epub 2018年1月23日。

成纤维细胞生长因子2通过SNAI1介导的角膜内皮细胞CDK2和ZEB1活化诱导增殖和纤维化

郑古利 1, 埃里克·荣格 1, 马丁·赫尔 2
附属公司
比较研究

成纤维细胞生长因子2通过SNAI1介导的角膜内皮细胞CDK2和ZEB1活化诱导增殖和纤维化

Jeong Goo Lee（李正国）等。 生物化学杂志. .

摘要

研究角膜内皮细胞（CECs）内源性伤口愈合刺激可能有助于减少因内皮功能障碍而失明的角膜移植数量，从而解决全球供体角膜短缺的问题。我们先前报道，IL-1β刺激导致成纤维细胞生长因子（FGF2）表达，增强哺乳动物CECs的迁移和增殖。然而，FGF2也促进内皮-间充质转化，从而导致角膜后膜的形成和失明。这促使我们研究下游FGF2信号靶点，这些靶点可以被操纵以防止角膜后膜的形成。FGF2刺激改变细胞形态并诱导间充质过渡标记基因的表达，如蜗牛家族转录抑制因子1(斯奈伊1),斯奈2，锌指电子盒-绑定同源盒1(ZEB1号机组)、和ZEB2型这反过来诱导了CEC中纤维连接蛋白、波形蛋白和I型胶原的表达，并抑制了E-钙粘蛋白在体外和体外siRNA-介导的SNAI1敲除表明，SNAI1诱导ZEB1表达，进而诱导I型胶原（角膜后膜的主要成分）、细胞周期素依赖性激酶2（CDK2）和细胞周期素E1的表达，促进细胞增殖。siRNA-介导的击倒斯奈伊1或ZEB1号机组，但不是的CDK2型抑制纤维连接蛋白、波形蛋白和I型胶原的FGF2依赖性表达，并抑制E-钙粘蛋白的表达。我们得出结论，SNAI1是人类FGF2依赖性间充质转化的关键调节因子体外角膜内皮，ZEB1调节I型胶原表达，CDK2调节细胞增殖。这些结果表明，SNAI1通过ZEB1和CDK2促进人角膜内皮纤维化和细胞增殖。

关键词：FGF2；SNAI1；ZEB1；角膜；角膜内皮；内皮-间充质转化；内皮；成纤维细胞生长因子；纤维化；间充质转化；锌指。

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数字

图1。
图1。
FGF2诱导人原代角膜内皮细胞间充质转化相关基因表达在体外. A类FGF2刺激45天后，角膜内皮细胞（CEC）的多边形细胞形态改变为细长纺锤形，而载体对照组CEC的形态正常。B类，经过指定时间的治疗(d日纯化CEC总RNA并进行RT-PCR。标记归纳法COL1A1公司，斯奈伊COL1A2，SNAI2公司，泽布1，以及ZEB2型在FGF2中发现，但在经溶媒对照治疗的人类原发CEC中未发现。α的表达座椅模块组件和扭转FGF2处理没有改变。COL8A2系列和β-肌动蛋白分别作为角膜内皮标志物和负荷对照。车辆C，车辆控制。
图2。
图2。
FGF2在转录水平调节人骨髓间充质转化和增殖相关基因的表达体外角膜内皮。经过指定时间的处理后，人类总RNA体外纯化角膜内皮细胞并进行RT-PCR。A类，的表达式斯奈伊1，SNAI2公司，ZEB1号机组，以及ZEB2FGF2处理以时间依赖的方式增加。用溶媒控制治疗无效。B类，FGF2处理导致COL1A1公司，COL1A2公司，纤维连接蛋白，以及波形蛋白，虽然它抑制了E-钙粘蛋白类似于人类CEC在体外，FGF2处理对α座椅模块组件。C类，表达增加CDK2型和细胞周期蛋白E1在FGF2处理的人中也发现了，但在溶媒对照组治疗的人中没有发现体外角膜内皮。COL8A2系列和β-肌动蛋白分别作为角膜内皮标志物和负荷控制。车辆C，车辆控制。
图3。
图3。
FGF2在翻译水平上调节人骨髓间充质转化和增殖相关基因的表达体外角膜内皮。人类治疗后体外在指定的时间（0或14天）内，从内皮Descemet膜复合物中分离总蛋白。A类在FGF2处理的人中，发现SNAI1、SNAI2、ZEB1和ZEB2的蛋白质水平增加，但在溶媒对照处理的人则没有发现体外角膜内皮。B类在FGF2治疗的人中观察到COL1、纤维连接蛋白和波形蛋白的表达增加以及E-钙粘蛋白的抑制，但在溶媒对照治疗的人体外角膜内皮。FGF2处理对αSMA蛋白的表达也没有影响。C类FGF2处理的人CDK2和cyclin E1蛋白水平也增加，但在溶媒对照处理的人中没有增加体外角膜内皮。D类分别以COL8A2和角蛋白12作为角膜内皮和上皮的标记物，以β-actin作为负荷对照。车辆C，车辆控制。
图4。
图4。
FGF2通过SNAI1在转录水平调节人原代角膜内皮细胞中的间充质转化和增殖相关基因表达在体外. A类为了确定SNAI1 siRNA的应用时间点，用SNAI1 siRNA转染人原代角膜内皮细胞，并在转染后的指定时间（3、7或14天）分离总蛋白。在转染后14天内观察到FGF2依赖性SNAI1蛋白表达的siRNA敲低。角蛋白12被用作角膜上皮细胞污染的对照。B类，SNAI1 siRNA敲除FGF2依赖性斯奈伊1，SNAI2公司，ZEB1号机组，以及ZEB2型在人原发性CEC中表达。C类，SNAI1 siRNA敲除导致FGF2依赖性表达的抑制COL1A1公司，COL1A2公司，以及纤维连接蛋白; 然而，在表达波形蛋白SNAI1 siRNA也逆转了E-cadherin的FGF2依赖性抑制。D类，SNAI1 siRNA转染抑制FGF2依赖性表达CDK2型和细胞周期蛋白E1在初级人类CEC中。COL8A2系列和β-肌动蛋白分别作为角膜内皮标志物和负荷控制。在所有实验中，用非靶向对照siRNA转染对基因表达没有任何影响。车辆C、车辆控制；Epi公司，角膜上皮；NT公司，非目标控制。
图5。
图5。
FGF2通过SNAI1在转录水平调节人骨髓间充质转化和增殖相关基因的表达体外角膜内皮。 A类，SNAI1 siRNA敲除减弱FGF2依赖性表达斯奈伊1，SNAI2公司，ZEB1号机组，以及ZEB2型在人体内体外角膜内皮。B类，SNAI1 siRNA敲除降低FGF2依赖性表达COL1A1公司，COL1A2公司，纤维连接蛋白，以及波形蛋白FGF2依赖性抑制E-钙粘蛋白SNAI1 siRNA敲除表达。C类，SNAI1 siRNA敲除减弱FGF2依赖性表达CDK2型和细胞周期蛋白E1在所有实验中，非靶向siRNA转染对基因表达没有影响。COL8A2系列和β-肌动蛋白分别作为角膜内皮标志物和负荷控制。车辆C、车辆控制；NT公司，非目标控制。
图6。
图6。
FGF2通过SNAI1在翻译水平调节人骨髓间充质转化和增殖相关基因的表达体外角膜内皮。 A类，SNAI1 siRNA敲除抑制SNAI1、SNAI2、ZEB1和ZEB2蛋白的FGF2依赖性表达。B类COL1、纤维连接蛋白和波形蛋白的FGF2依赖性表达受到SNAI1 siRNA敲除的抑制。SNAI1 siRNA敲除也抑制了E-cadherin的FGF2依赖性抑制。C类SNAI1 siRNA敲除抑制CDK2和CCNE1的FGF2依赖性表达。在所有实验中，用非靶向对照siRNA转染并没有改变基因表达。COL8A2和β-肌动蛋白分别作为角膜内皮标志物和负荷对照。车辆C、车辆控制；NT公司，非目标控制。
图7。
图7。
ZEB1调节人类纤维化，但不调节增殖体外角膜内皮。 A类和B类，RT-PCR(A类)和蛋白质印迹(B类)显示ZEB1 siRNA敲除抑制COL1、纤维连接蛋白和波形蛋白的FGF2依赖性表达，并抑制E-cadherin的FGF2-依赖性抑制。SNAI1、SNAI2和ZEB2水平不受ZEB1 siRNA敲除的影响。ZEB1 siRNA转染也不影响CDK2和cyclin E1的FGF2依赖性表达。在所有实验中，用非靶向对照siRNA转染并没有改变基因表达。COL8A2和β-肌动蛋白分别作为角膜内皮标志物和负荷对照。车辆C、车辆控制；NT公司，非目标控制。
图8。
图8。
CDK2调节人的增殖而非纤维化体外角膜内皮。 A类和B类，逆转录聚合酶链式反应(A类)和免疫印迹(B类)显示CDK2 siRNA敲除抑制CDK的FGF2依赖性表达，但不抑制细胞周期蛋白E1。此外，CDK2 siRNA敲除并没有改变SNAI1、SNAI2、ZEB1、ZEB2、纤维连接蛋白、波形蛋白和I型胶原的FGF2依赖性表达。CDK2 siRNA敲除对E-cadherin的FGF2依赖性抑制也有影响。在所有实验中，用非靶向对照siRNA转染并没有改变基因表达。COL8A2和β-actin分别作为角膜内皮标志物和负荷对照。车辆C、车辆控制；NT公司，非目标控制。
图9。
图9。
FGF2通过SNAI1而非ZEB1促进人类增殖体外角膜内皮。 A类人受伤后的FGF2治疗体外角膜内皮诱导组蛋白H3磷酸化(第3页)在原子核中(绿色)损伤部位附近的内皮细胞。SNAI1或CDK2 siRNA敲低可严重减弱FGF2诱导的组蛋白H3磷酸化，但ZEB1 siRNA敲除则不能。用非靶向控制siRNA转染对FGF2诱导的组蛋白H3磷酸化没有影响。使用抗ZO-1抗体观察角膜内皮细胞膜(红色)抗体和细胞核用DAPI染色(蓝色).比例尺=50微米。B类与溶媒对照组相比，FGF2处理增加了人的相对增殖率体外角膜内皮，15.3±4.5与1.0 ± 1.52,第页< 0.05. 与单独FGF2治疗相比，SNAI1和CDK2 siRNA敲除降低了相对增殖率，为3.35±2.26与15.3 ± 4.5,*, 第页<0.05和2.2±1.24与15.3 ± 4.5, **,第页分别<0.05。ZEB1 siRNA敲除的相对增殖率没有显著变化与单独FGF2治疗，14.7±3.23与15.3 ± 4.5. 单向方差分析，F类(5,9) = 9.0,第页< 0.003,n个=每个样本9个。Tukey的事后检验，HSD[0.05]=11.4和HSD[0.01]=15.0。车辆C、车辆控制；NT公司，非目标控制。
图10。
图10。
FGF2信号通过SNAI1和ZEB1增强人角膜内皮细胞的间充质转化。FGF2诱导的SNAI1激活平行且独立的ZEB1和CDK2通路，从而调节纤维化和增殖。
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