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.2018年1月18日；8(1):1163.
doi:10.1038/s41598-018-19587-5。

线粒体-tRNA修饰酶MTO1和GTPBP3的缺陷通过HIF-PPARγ-UCP2-AMPK轴促进不同的代谢重编程

拉希德·布图瓦尔 1 2, 萨尔瓦多·梅塞盖尔 三, 马格达·维拉罗亚 1, 埃琳娜·马丁·埃尔南德斯 4, 穆罕默德·埃拉米 2, 米格尔·马丁 5 6, 玛尔塔·卡萨多 7 8, M-Eugenia Armengod公司 9 10
附属公司

线粒体-tRNA修饰酶MTO1和GTPBP3的缺陷通过HIF-PPARγ-UCP2-AMPK轴促进不同的代谢重编程

拉希德·布图瓦尔等。 科学代表. .

摘要

人类蛋白质MTO1和GTPBP3被认为共同催化线粒体tRNA中摆动尿苷的修饰。每种蛋白质的缺陷都会导致婴儿肥厚型心肌病伴乳酸酸中毒。然而，其潜在机制大多是未知的。使用MTO1患者的成纤维细胞和MTO1沉默细胞，我们发现MTO1缺乏与AMPK失活、解偶联蛋白2（UCP2）和转录因子PPARγ下调以及缺氧诱导因子1（HIF-1）激活介导的代谢重编程有关。因此，糖酵解和氧化磷酸化被解偶联，而脂肪酸代谢被改变，导致脂质滴在MTO1成纤维细胞中积聚。出乎意料的是，这种反应与GTPBP3缺陷所触发的反应不同，因为GTPBP3-depleted细胞表现出AMPK激活，UCP2和PPARγ水平增加，HIF-1失活。此外，脂肪酸氧化和呼吸在这些细胞中受到刺激。因此，HIF-PPARγ-UCP2-AMPK轴在MTO1-和GTPBP3-缺陷细胞中的运行方式不同，这强烈表明，除了线粒体-tRNA修饰外，这些蛋白中的一个还具有其他作用。这项工作为MTO1和GTPBP3缺陷的分子基础以及治疗干预的假定靶点提供了新的有用信息。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
从MTO1缺陷细胞纯化的mt-tRNAs的血管生成素敏感性。（A）和B）mt-tRNA的Northern分析赖氨酸（上面板）和mt-tRNA瓦尔（下面板）后分子在体外从野生型（WT HF）和MTO1（MTO1 HF）人成纤维细胞纯化的小RNA的血管生成素（ANG）消化(A类)和来自MTO1 siRNA 1-和阴性对照（NC）siRNA转染的143B细胞(B类)用于1、2和3 h.补充信息中包括全长印迹（图S17）。血管生成素消化的动力学分析绘制在代表性的northern印迹下方。0、1、2和3后完整mt-tRNA的数量 用血管生成素孵育的h表示为相对于未消化对照组的折叠变化（0 h） ●●●●。(C）qRT-PCR分析MTO1公司MTO1 HF中的mRNA。数据表示为相对于WT HF的倍数变化。（D）MTO1 HF和WT HF中MTO1蛋白表达的代表性免疫印迹。还使用抗孔蛋白的抗体探测膜，该抗体用作负荷控制。补充信息中包括全长蛋白质印迹（图S18）。散点图显示了归一化为载荷控制的MTO1密度分析，并表示为相对于WT HF的折叠变化。所有数据均为平均值 ± 至少三个独立生物复制的SD。发现与WT或NC值的差异在*p具有统计学意义 < 0.05和**p < 0.01. 注：无显著差异。
图2
图2
MTO1缺陷细胞表现出蛋白质平衡应激和生物能量状态改变。（A）和B）显示WT和MTO1 HF提取物中CLPP、AFG3L2和LONP1表达的代表性免疫印迹(A类)以及在MTO1 siRNA 1-、MTO1 siRNA 2-和阴性对照（NC）siRNA转染的143B细胞中(B类). 孔蛋白被用作负荷控制。补充信息中包括全长印迹（图S19）。散点图显示了与负载控制标准化的丝裂原蛋白酶的密度测量值，并表示为相对于控制细胞的折叠变化。（C）和D）WT和MTO1 HF中OXPHOS复合物的代表性蓝色天然PAGE(C类)以及在MTO1 siRNA 1-、MTO1 siRNA 2-和NC siRNA转染的143B细胞中(D类). 补充信息中包括络合物III的全长印迹和低暴露印迹（图S20）。散点图显示了归一化为络合物II（负载控制）的OXPHOS络合物的密度测量值，并表示为相对于对照细胞的折叠变化。（E）使用不同OXPHOS抑制剂分析完整细胞的耗氧率（OCR）。在基础条件下，依次添加寡霉素、羰基氰化物对三氟甲氧基苯腙（CCCP）、鱼藤酮和抗霉素A后，测量每种细胞类型的OCR。散点图显示基础OCR（根据寡霉素前的OCR和鱼藤酮/抗霉素后的OCR之差确定），ATP-连锁OCR（寡霉素治疗前后OCR的差异）、质子泄漏（基础OCR和ATP-关联OCR的区别）、储备能力（CCCP刺激率和基础OCR的差别）、非线粒体OCR（鱼藤酮和抗霉素A治疗后OCR）、，和最大OCR（CCCP后的OCR和非线粒体OCR之间的差异）。（F）和G）成纤维细胞总ATP和线粒体ATP水平的测定(F类)和MTO1沉默的143B细胞(G公司). 细胞与5 mM葡萄糖或2.5 mM 2-脱氧-d-葡萄糖加2.5 mM丙酮酸（分别为左和右），以确定总ATP和线粒体ATP水平。数据表示为相对于WT HF的折叠变化(F类)或NC siRNA-转染的143B细胞(G公司)值。所有数据均为平均值 ± 至少三个不同实验的SD。在*p时，发现与对照值的差异具有统计学意义 < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001. 注：无显著差异。
图3
图3
MTO1和GTPBP3缺陷对AMPK/UCP2轴产生相反的影响。（A、E和一）野生型（WT HF）和MTO1（MTO1 HF）人成纤维细胞中磷酸-Thr172-AMPKα和UCP2的代表性免疫印迹(A类)，在MTO1 siRNA1-、MTO1 SiRNA2-和NC siRNA-转染的143B细胞中(E类)以及在GTPBP3 siRNA1-、GTPBP3-siRNA2-和NC siRNA-转染的143B细胞中(我). AMPKα和孔蛋白作为负荷对照。全长蛋白质印迹包含在补充信息中（图S21）。（B、F和J）磷酸化-Thr172-AMPKα归一化为AMPKα的密度分析，表示为相对于对照细胞的折叠变化。（C、G和K）UCP2的密度分析归一化为孔蛋白，并表示为相对于对照细胞的折叠变化。（D、H和L）qRT-PCR分析UCP2号机组野生型和MTO1 HF中的mRNA表达(D类)，在MTO1 siRNA1-、MTO1 SiRNA2-和NC siRNA-转染的143B细胞中(H（H）)以及在GTPBP3 siRNA1-、GTPBP3-siRNA2-和NC siRNA-转染的143B细胞中(L（左）). 所有数据均为平均值 ± 至少三个不同实验的SD。在*p时，发现与对照值的差异具有统计学意义 < 0.05，**p < 0.01和***p < 0.001. NC：阴性对照。
图4
图4
MTO1和GTPBP3缺陷细胞中PPAR因子的表达。(A）qRT-PCR分析PPARα、β/δ和γMTO1人成纤维细胞（MTO1 HF）mRNA表达。数据表示为相对于WT HF值的折叠变化(B、 C类和D类)WT和MTO1 HF中PPARγ的代表性免疫印迹(B类)，在MTO1 siRNA1-、MTO1 SiRNA2-和NC siRNA-转染的143B细胞中(C类)以及在GTPBP3 siRNA1-、GTPBP3-siRNA2-和NC siRNA-转染的143B细胞中(D类). 用一种针对孔蛋白的抗体对膜进行检测，该抗体被用作负荷控制。补充信息中包括全长蛋白质印迹（图S22）。散点图显示PPARγ归一化为孔蛋白的密度分析，并表示为相对于对照细胞的折叠变化。所有数据均为平均值 ± 至少三个不同实验的SD。在*p时，发现与对照值的差异具有统计学意义 < 0.05和**p < 0.01. 注：无显著差异。NC：阴性对照。
图5
图5
在MTO1成纤维细胞中，UCP2的调节是AMPK和PPARγ依赖性的。（A）qRT-PCR分析UCP2号机组用5μM罗格列酮（RGZ）处理或不处理MTO1人成纤维细胞（MTO1 HF）1 h.数据表示为相对于WT HF值的折叠变化。（B）WT HF和MTO1 HF中磷酸-Thr172-AMPKα、AMPKα和UCP2的代表性免疫印迹，用5μM RGZ处理或不处理1 h.使用孔蛋白和AMPKα作为负荷控制。补充信息中包括全长蛋白质印迹（图S23）。散点图显示了归一化为孔蛋白的UCP2和归一化为AMPKα的磷酸-Thr172-AMPKα的密度测量数据，并表示为相对于WT HF的倍数变化。（C）WT HF和MTO1 HF中磷酸-Thr172-AMPKα、AMPKα和UCP2的代表性免疫印迹，用1 mM AICAR用于1 h.使用孔蛋白作为负荷控制。补充信息中包括全长蛋白质印迹（图S23）。散点图显示了归一化为孔蛋白的UCP2和归一化成AMPKα的磷光体Thr172-AMPKα的密度测量数据，并表示为相对于WT HF的折叠变化。所有数据均为平均值 ± 至少三个不同实验的SD。与WT HF值的差异在*p时具有统计学意义 < 0.05，**p < 0.01和***p < 0.001.
图6
图6
MTO1和GTPBP3缺陷对HIF-1信号产生相反的影响。(A、 D类和G）qRT-PCR分析HIF-1型MTO1 HF中mRNA的表达(A类)，在MTO1 siRNA1-和MTO1 SIRNA2-转染的143B细胞中(D类)以及在GTPBP3 siRNA1-和GTPBP3-siRNA2-转染的143B细胞中(G公司).（B、E和H）MTO1 HF中HIF-1的代表性免疫印迹(B类)，在MTO1 siRNA1-和MTO1 siRNA2-转染的细胞中(E类)以及在GTPBP3 siRNA1-和GTPBP3-siRNA2-转染细胞中(H（H）). 孔蛋白被用作负荷控制。补充信息中包括全长蛋白质印迹（图S24）。散点图显示了归一化为孔蛋白的HIF-1密度测量数据，并表示为相对于WT HF的折叠变化(B类)或NC siRNA转染细胞(E类和H（H）).（C）,F类和一）HIF-1靶基因mRNA表达的qRT-PCR分析血管内皮生长因子(血管内皮生长因子)和血小板衍生生长因子亚单位2(血小板衍生生长因子2)以MTO1 HF为单位(C类)，在MTO1 siRNA1-和MTO1 siRNA2-转染的细胞中(F类)以及在GTPBP3 siRNA1-和GTPBP3-siRNA2-转染细胞中(我). 所有数据均为平均值 ± 至少三个不同实验的SD，表示为WT HF或NC siRNA转染细胞的折叠变化。发现与WT或NC值的差异在*p具有统计学意义 < 0.05，**p < 0.01和***p < 0.001. 注：无显著差异。NC：阴性对照。
图7
图7
MTO1缺陷细胞表现出代谢基因表达的改变，并且在生物能量学方面与GTPBP3缺陷细胞不同。(A类)糖酵解相关基因mRNA表达的qRT-PCR分析(GLUT1：葡萄糖转运蛋白1，PKF1：磷酸果糖激酶，LDHA和LDHB：乳酸脱氢酶A和B、 PDK4:丙酮酸脱氢酶激酶4和MPC1：线粒体丙酮酸载体1); 谷氨酰胺水解(ASCT2：谷氨酰胺/氨基酸转运蛋白2，SN2：谷氨酰胺/氨基酸转运蛋白系统N、和GLS：谷氨酰胺酶); 细胞脂肪酸（FA）摄取(FAT/CD36：脂肪酸转定位酶、和FABP3：脂肪酸结合蛋白3); 线粒体脂肪酸（FA）摄取(CPT1a公司和CPT1b：肉碱棕榈酰转移酶Ⅰa和b条); 脂肪酸氧化(LCAD：长链酰基辅酶A脱氢酶，MCAD：中链酰基CoA脱氢酶、和HADH：羟酰辅酶A脱氢酶); 脂肪酸合成(ACC：乙酰辅酶A羧化酶和FAS：脂肪酸合成酶)在MTO1（MTO1 HF）人成纤维细胞中。数据表示为相对于WT HF的折叠变化，并显示在热图中。颜色和log2刻度中的相应值绘制在右侧。(B类)5存在下洋地黄素渗透细胞的耗氧率 mM ADP，0.2 mM辛酰肉碱（Oct）和苹果酸(M（M）)以三种不同浓度（0.05、0.1和2）添加 mM）。(C类)5存在下洋地黄素渗透细胞的耗氧率 mM ADP，0.2 mM辛酰肉碱（10月），2 mM苹果酸(M（M）)以及在为复合物I（5）连续添加基底之后 mM丙酮酸(P（P）)和10 mM谷氨酸盐(G公司); PGMOctp）和复合物II（琥珀酸盐(S公司); PGMSOctp）、解偶联剂羰基氰化物对三氟甲氧基苯腙（CCCP，逐步滴定，增量0.05μM；PGMSOct）和复合物I抑制剂（0.5μM鱼藤酮；硒）。将耗氧率（OCRs）标准化为每个样本中的线粒体拷贝数（mtDNA/nDNA比率），用皮摩尔（pmol）/秒/百万细胞（Mill）表示。p表示ADP的磷酸化 + Pi至ATP。e表示电子传递系统（ETS）在最佳CCCP浓度下的容量（非耦合呼吸）。数据代表手段 ± SD来自至少3次独立测定。在*p时，发现与野生型（WT）或阴性对照（NC）值的差异具有统计学意义 < 0.05，**p < 0.01和***p < 0.001. 注：无显著差异。
图8
图8
MTO1突变p.Arg464Cys导致MTO1成纤维细胞中的脂质积聚。（A）在正常条件下（顶部面板），用5μM罗格列酮（RGZ）处理（中间面板），并暴露于200μM BSA-共轭油酸（底部面板），野生型（WT HF）和MTO1（MTO1 HF）人成纤维细胞内用油红O（ORO）染色的细胞内脂滴的代表性显微镜照片。（B）含有脂滴（红色）的细胞与细胞总数的比率。结果表示为相对于WT HF的折叠变化。数据表示平均值 ± SD来自至少3次独立测定。与WT HF值的差异在*p时具有统计学意义 < 0.05和**p < 0.01之间。（C）WT HF和MTO1 HF的代表性电子显微照片（放大倍率x8200）显示了MTO1高频中的脂滴。黄色箭头表示脂滴。比例尺对应500 纳米。图片是来自至少三个独立实验的代表。
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