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.2018年4月1日；29(7):809-819.
doi:10.1091/mbc。E17-10-0619。

细胞内小泡运输在线粒体质量控制中起着重要作用

迈克·杰拉德 1 2, 朱塞佩·坎尼诺 1, 何塞·M·冈萨雷斯·德·科扎尔 1, 霍华德·雅各布斯 1 三
附属公司

细胞内小泡运输在线粒体质量控制中起着重要作用

迈克·杰拉德等。 分子生物学细胞. .

摘要

这个果蝇属基因产物Bet1、Slh和CG10144被预测在细胞内小泡运输中起作用，此前发现它们对线粒体核仁维持至关重要。这里我们显示Slh和Bet1协同维持线粒体功能。在没有它们的情况下，线粒体含量、膜电位和呼吸变得异常，伴随着线粒体蛋白毒性应激，但对线粒体DNA没有直接影响。免疫细胞化学显示Slh和Bet1定位于高尔基体，以及一定比例的Rab5阳性小泡。一些Bet1和少量Slh与高度纯化的线粒体共分馏，而活细胞成像显示荧光标记的Bet1与大多数Lysotracker阳性和一小部分Mitotracker阳性结构一致。尽管仍然可以看到共定位溶酶体和线粒体信号，但在Slh敲除的细胞中，这种三向关联被破坏。Slh和Bet1均不需要进行全局有丝分裂或内吞，但Slh敲除延长导致G2生长停滞，细胞直径增加。这些影响与βCOP的敲除有关，但与CG1044、Snap24或Syntaxin6的敲除无关。我们的发现表明囊泡在顺式-高尔基体在线粒体质量控制中的作用。

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数字

图1：
图1：
Slh、Bet1或CG10144敲除不影响mtDNA拷贝数、拓扑或完整性。（A） 所示基因的相对RNA水平，根据RpL32 RNA进行标准化，然后根据未经处理的S2细胞的值进行重新标准化，以及（B）相对mtDNA拷贝数（基于qPCR），也根据未经治疗的S2电池的值进行标准化。平均值±SD，与对照细胞（学生的t吨使用Bonferroni校正进行测试，n个≥4个生物重复），用*表示(第页<0.01）和#(第页< 0.05). （C） 线粒体DNA的Southern blot，±消化Pst（磅/平方英尺）一、 在显示的天数内，从未经处理的S2细胞或用dsRNAs针对指定基因处理的细胞中提取。mtDNA的主要拓扑形式表示为OC（开圆）、L（线性）和SC（超螺旋圆）。
图2：
图2：
Slh敲除损害线粒体功能。（A） 线粒体O2消耗量，根据细胞数量归一化，（B）每细胞TMRM荧光，（C）每细胞Mitotracker绿色荧光，（D，E）每细胞（D）TMRM荧光和（E）Mitotraker绿色荧光变化的时间进程，以及（F）指示基因的相对RNA水平，根据RpL32 RNA归一化；在所示的天数内，用dsRNAs对所示基因处理的细胞中，根据未经处理的S2细胞的值对所有基因进行重新规范化。（A–C，F）平均值±SD，与对照细胞（学生的t吨使用Bonferroni校正进行测试，n个≥4个生物重复），用*表示(第页<0.01）和#(第页< 0.05). （D，E）时间进程平均值（源数据，包括SD和统计分析，见补充表S1）；请注意年轴不从0开始。
图3：
图3：
基于表位标记，Bet1和Slh定位于多细胞膜。标记物Cox4（线粒体）、GM130的免疫细胞化学(顺式-高尔基体）、Rab5（早期内体），在用（A）Bet1-V5或（B）Slh-V5瞬时转染的细胞中，如图所示。图像在显微镜上进行了亮度和对比度优化，但除了添加文本中提到的面板标签外，没有以任何其他方式进行操作。（C） Bet1-V5和Slh-V5转染细胞蛋白提取物的蛋白质印迹，如图所示进行探测。T-细胞总提取物，20μg，C，细胞质（线粒体后）部分，20μg；M、 高纯度线粒体部分，显示为稀释度增加（20,10,4μg）。根据分子量标记的迁移推断出检测条带的外推分子量（kDa），如图所示。请注意果蝇属Cox4与哺乳动物一样，在~15 kDa的SDS–12%PAGE凝胶上运行；其N端处理未知。Slh-V5为～74 kDa，但在SDS–PAGE上迁移接近80 kDa。Blot图像针对亮度和对比度进行了优化，裁剪并调整了大小以提高清晰度，但没有以任何其他方式进行操作。
图4：
图4：
Bet1和Slh基因敲除导致高尔基体增大。（A） GM130的免疫细胞化学(顺式-高尔基体标记）的细胞被dsRNA处理5天，靶向指定的基因，缩放图像显示典型细胞。（B） 表面积，使用ImageJ软件计算，以及（C）每个细胞的高尔基小泡数量，基于这些图像（每个案例中≥60个细胞）。平均值±SD；#，*表示与对照（con）细胞（学生的t吨Bonferroni校正试验，第页<0.05和第页分别<0.01）。图像在显微镜上进行了亮度和对比度优化，但除了添加文本中提到的面板标签外，没有以任何其他方式进行操作。请注意，表面积增加约60%表示体积的两倍变化。
图5：
图5：
Slh是Bet1与溶酶体和线粒体成分结合所必需的。（A） Bet1-BFP转染细胞的代表性活细胞图像，无论是单独（对照S2细胞，con，面板A–d）还是伴随Slh敲除（面板e–h），与Lysotracker Red和Mitotracker Green协同，以及（插入）高倍放大的缩放图像。白色箭头表示小泡对Mitotracker Green和Lysotracker Red呈阳性，而在对照细胞中，而不是Slh敲除细胞中，这些小泡对Bet1-GFP大多呈阳性。图像在显微镜上进行了亮度和对比度优化，但除了添加此处和文本中提到的面板标签和箭头外，没有以任何其他方式进行操作。（B） 基于对所分析的每类8个细胞中所有可见荧光结构的检查，与Mitotracker Green和Lysotracker Red共染色的结构的定量（%），这些结构对Bet1 BFP也呈阳性。con，对照转染Bet1-BFP的S2细胞；Slh KD，Slh的细胞也被敲倒。*表示统计上的显著差异，第页<0.001，学生t吨测试。
图6：
图6：
有丝分裂或内吞不需要Slh。（A） 对照S2细胞和Slh敲除细胞的活细胞成像，用5μM FCCP处理2小时，并用Mitotracker Green和Lysotracker Red染色。这两种情况下，两种探针几乎完全重叠，表明Slh敲除不会干扰全局线粒体自噬。（B） 未经处理的S2细胞和被Bet1或Slh敲除或用GFP靶向的惰性dsRNA处理的细胞中酸化的晚期内体和内溶酶体的可视化。所有细胞中都可以看到对pH敏感的非发酵右旋糖酐结合染料pHrodo红右旋糖苷产生的红色荧光。
图7：
图7：
Slh和Bet1敲除导致细胞生长缺陷。（A） 对照S2细胞和连续处理10天的细胞的生长曲线，dsRNAs靶向指定基因，转染后5天开始。对于源数据，包括SD和统计分析，在对第5天的细胞数进行归一化后，请参阅补充表S1。（B） 对照S2细胞和被dsRNAs靶向指定基因敲除10天的细胞的细胞周期分析。（C） 对照S2细胞和用针对指定基因的dsRNAs治疗5天后的细胞的显微照片。比例尺：20μm。（D） 对照S2细胞和所示基因敲除细胞的细胞直径（每类52个细胞的平均值±SD）。#，*表示与控制单元的相应数据类别（学生的t吨使用Bonferroni校正进行测试，第页分别<0.05或0.001）。
图8：
图8：
分泌途径的高尔基后成分不需要维持线粒体质量和细胞生长。（A） 与对照细胞相比，对所示基因进行dsRNA处理5天后的相对细胞数。另请参见补充图S3。（B） 对指定基因进行dsRNA处理后，Hsp22 RNA的相对水平根据RpL32 RNA进行标准化，并根据未经处理的S2细胞的值进行重新标准化。由于βCOP敲除5天后剩余的活细胞太少，因此在敲除2天后评估RNA水平。平均值±SD；与对照细胞的显著差异（学生t吨使用Bonferroni校正进行测试，n个≥4个生物重复），用*表示(第页< 0.05). （C） 靶向所示基因的dsRNAs治疗5天后S2细胞的显微照片。比例尺：20μm。（D） 对照（S2）细胞和因指示基因而被敲除的细胞的细胞直径（平均每类52个细胞的±SD）。*表示与控制单元的相应数据类别（学生的t吨使用Bonferroni校正进行测试，第页< 0.001).
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