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.2017年12月4日；8(67):111807-111818.
doi:10.18632/oncotarget.22910。 eCollection 2017年12月19日。

亮氨酸通过激活PI3K/Akt通路介导自噬体-溶酶体融合并提高精子活力

金章 1, 张雪梅 1, 刘英杰 1, 苏子豪 1, 农民Ullah Dawar 1, 洪丹 1, 阎和 1, 建房贵 1 2, 杰梅 1
附属公司

亮氨酸通过激活PI3K/Akt通路介导自噬体-溶酶体融合并提高精子活力

金章（Jin Zhang）等。 肿瘤靶点. .

摘要

补充氨基酸是提高精子质量的有效策略。在我们的研究中，对筛选游离氨基酸以提高精子活力进行了比较研究，我们发现亮氨酸是最有效的一种。亮氨酸治疗依赖于PI3K/Akt信号通路的激活来增加精子运动，而PI3K/Akt信号的化学抑制剂可以减少亮氨酸治疗激活的pAkt数量。此外，亮氨酸治疗改善了P62和LC3-II的表达，显著抑制了斑马鱼睾丸的自噬过程。体外研究表明，亮氨酸可降低自噬体和溶酶体的融合，EGFP-LC3和溶酶体标记物的共定位表明了这一点。采用两种自噬化学调节剂，即LY294002（PI3K/Akt信号抑制剂）和氯喹，研究了自噬对斑马鱼精子运动的影响。LY294002抑制自噬体的形成以降低精子运动，而氯喹则抑制自噬体和溶酶体的融合以提高精子运动。我们的数据表明，亮氨酸短期治疗可以通过影响自噬和抑制自噬体与溶酶体的融合来提高斑马鱼精子的运动能力，这取决于PI3K/Akt信号通路的激活。

关键词：PI3K/Akt途径；自噬体-溶酶体融合；亮氨酸；精子活力。

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利益冲突声明

利益冲突作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突。

数字

图1
图1。亮氨酸处理对斑马鱼精子运动的影响——PI3K/Akt信号通路的激活
（A）亮氨酸处理后，典型的免疫印迹显示p-Akt和Akt蛋白。肌动蛋白作为对照。相对蛋白质水平由3个独立实验显示。（B）从3个独立实验中量化pAkt/Akt的比率。（C）mRNA表达PI3KR1和PI3KCA公司通过qRT-PCR进行检查。（D）对照组与亮氨酸处理组精液运动参数的比较。采用计算机辅助精子分析（CASA）系统评估了进行精子和慢精子两个运动学参数。（E）检测对照和亮氨酸处理的斑马鱼睾丸中mTOR和p-mTOR信号的代表性免疫荧光图片。比例尺：50μm。条形图表示三个以上单独实验的平均值±SEM。*P<0.05，**P＜0.01***P<0.001。
图2
图2。LY294002通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制精子运动
（A）LY294002治疗后，代表性免疫印迹显示p-Akt和Akt蛋白。肌动蛋白作为对照。相对蛋白质水平由3个独立实验显示。（B）从3个独立实验中量化pAkt/Akt的比率。（中-英）对照组与LY294002治疗组精液运动参数的比较。采用计算机辅助精子分析（CASA）系统对6个运动学参数进行了评估，包括运动精子（C）、进行精子和慢精子（D）、VAP、VSL和VCL（E）。条形图表示三个以上单独实验的平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。
图3
图3。亮氨酸处理对斑马鱼精子运动的影响在抑制PI3K/Akt信号通路后降低
（A）LY294002和亮氨酸治疗后，代表性免疫印迹显示p-Akt和Akt蛋白。肌动蛋白作为对照。相对蛋白质水平由3个独立实验显示。（B）从3个独立实验中量化pAkt/Akt的比率。（中-英）精液运动参数的比较。采用计算机辅助精子分析（CASA）系统对6个运动学参数进行了评估，包括运动精子（C）、进行精子和慢精子（D）、VAP、VSL和VCL（E）。条形图表示三个以上单独实验的平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。
图4
图4。IGF-1激活Akt信号并促进精子运动
（A）IGF-I给药后，典型的免疫印迹显示p-Akt和Akt蛋白。使用肌动蛋白作为对照。相对蛋白质水平由3个独立实验显示。（B）从3个独立实验中量化pAkt/Akt的比率。（中-英）比较精子运动参数，包括运动精子（C）、进行精子和慢精子（D）、VAP、VSL和VCL（E），并使用计算机辅助精子分析（CASA）系统进行评估。条形图代表三个以上单独实验的平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。
图5
图5。亮氨酸处理对斑马鱼睾丸自噬的影响
（A）自噬相关基因的mRNA表达atg5型,第7天,第12天和第62页通过qRT-PCR进行评估。（B）亮氨酸和LY294002给药后，代表性免疫印迹显示P62和Lc3蛋白。肌动蛋白作为对照。P62和Lc3-II的相对蛋白水平由3个独立实验显示。（C）检测对照和亮氨酸处理的斑马鱼睾丸中Lc3水平的代表性免疫荧光图片。比例尺：50μm。条形图表示三个以上单独实验的平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。
图6
图6。亮氨酸对HepG2细胞自噬体-溶酶体融合的抑制作用
进行细胞成像以分析LysoTracker染色的酸化小泡和GFP-Atg8/Lc3阳性自噬体在对照细胞和亮氨酸处理细胞中的共定位。比例尺：50μm和5μm。显示了三个独立实验的代表性静止图像。
图7
图7。LY294002和氯喹对斑马鱼睾丸自噬的影响
（A-B）LY294002（A）或CQ（B）给药后，代表性免疫印迹显示P62和Lc3蛋白。肌动蛋白作为对照。P62和Lc3-II的相对蛋白水平归一化为肌动蛋白，并从3个独立实验中显示。（C-D）对照组和CQ治疗组精液运动学参数的比较。采用计算机辅助精子分析（CASA）系统对进行性和慢速精子（C）、VAP、VSL和VCL（D）五个运动学参数进行了评估。条形图表示三个以上单独实验的平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。
图8
图8。斑马鱼精子运动中自噬化学调节剂作用的一个拟议模型
LY294002通过抑制PI3K/Akt通路和自噬体的形成来降低精子运动。氯喹抑制自噬体和溶酶体的融合，而亮氨酸激活PI3K/Akt通路并抑制自噬体和溶菌体的融合从而提高精子运动能力。
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参考文献

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