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.2017年11月6日；8(67):110994-111011.
doi:10.18632/目标22339。 eCollection 2017年12月19日。

C3G促进活化小鼠血小板选择性释放血管生成因子以调节血管生成和肿瘤转移

维克托·马丁·格拉纳多 1 2, 萨拉·奥尔蒂斯·里韦罗 1 2, 丽塔·卡莫纳 3, 萨拉·古铁雷斯-埃雷罗 1 2, 马里奥·巴雷拉 1, 劳拉·桑·塞贡多 1 2, 西莉亚·塞奎拉 4, 佩德罗·佩迪盖罗 2 5, 弗朗西斯科·洛扎诺 2 6, 弗朗西斯科·马丁·埃雷罗 2 5, 何塞·拉蒙·冈萨雷斯-波拉斯 2 7, 拉蒙·穆尼奥斯·查普利 3, 阿尔穆代娜·波拉斯 4, 卡门·格雷罗 1 2 8
附属公司

C3G促进活化小鼠血小板选择性释放血管生成因子以调节血管生成和肿瘤转移

维克托·马丁·格拉纳多等。 肿瘤靶点. .

摘要

先前的观察表明，C3G（RAPGEF1）促进α颗粒释放，血小板表面P-选择素活化后暴露量增加证明了这一点。本研究的目的是进一步表征C3G作为血小板释放调节剂的潜在功能及其在血管生成调节中的意义。蛋白质组分析显示，激活的转基因C3G和C3G∆猫血小板分泌的抗血管生成因子减少。因此，两种转基因血小板的分泌体都具有促血管生成的整体作用在体外用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和两种细胞进行毛细血管形成分析体内异位肿瘤生长模型。此外，转基因C3G在血小板中的表达大大增加了小鼠黑色素瘤细胞的转移。此外，免疫荧光显微镜显示，促血管生成因子VEGF和bFGF部分保留在C3G和C3GΔCat转基因小鼠凝血酶和ADP激活的小鼠血小板的α颗粒中。观察到的C3G和囊泡相关膜蛋白（Vamp）-7之间的相互作用可以解释这些结果。同时，凝血酶激活后，两种转基因血小板中血小板扩散增加，支持了C3G在α颗粒胞吐中的这种新功能。总之，我们的数据指出，Rap1GEF依赖性和独立性机制共同存在，它们介导C3G对血小板分泌的影响，从而调节肿瘤和其他情况下的病理性血管生成。本文的结果支持血小板C3G在血管生成和转移中的重要作用。

关键词：C3G；Vamp-7；血管生成；转移；血小板分泌体。

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利益冲突声明

利益冲突作者声明没有相互竞争的财务利益。

数字

图1
图1。C3G调节ADP和凝血酶刺激血小板中VEGF、bFGF、内皮抑素和TSP-1的释放
双免疫荧光共聚焦显微镜图像显示VEGF（左）、内皮抑素（中）和覆盖物（右）在三种典型的ADP活化小鼠血小板中的亚细胞分布(A类)或凝血酶激活的小鼠血小板(B类)来自每个基因型。在搅拌条件下激活血小板5分钟。所有显微照片均在相同的曝光时间拍摄。比例尺：0.4µm。图表显示了VEGF免疫荧光强度的任意值（平均值±SEM）(C类)或内皮抑素(D类)在ADP或凝血酶处理的血小板中。(E类)所示基因型凝血酶激活血小板中TSP-1和bFGF亚细胞分布的典型共焦显微镜图像。所有显微照片均在相同的曝光时间拍摄。比例尺：0.4µm。图表显示TSP-1的免疫荧光强度的任意值（平均值±SEM）(F类)或bFGF(G公司)在每个基因型中。*第页< 0.05;**第页< 0.01.
图2
图2。C3G与血管内皮生长因子在ADP刺激的tgC3G小鼠血小板中的相互作用
(A类)双免疫荧光共聚焦显微镜图像显示VEGF（左）、C3G（中）和覆盖物（右）在每组三个典型的ADP刺激小鼠血小板中的亚细胞分布。用兔抗C3G抗血清#1008检测到C3G[33]。所有显微照片均在相同的曝光时间拍摄。比例尺：0.4µm。(B类)该图显示了VEGF和C3G共定位的Manders相关系数（平均值±SEM）。**第页< 0.01.
图3
图3。tgC3G和tgC3G∆Cat血小板中VEGF的释放受损
(A类)在静息状态或凝血酶或ADP刺激下，对所示基因型（每组4只小鼠）小鼠血小板的细胞裂解物中的VEGF和TSP-1进行Western blot分析。使用来自Sigma-Aldrich的抗β-肌动蛋白（AC-15）和抗β-微管蛋白（2-28-33）抗体作为负荷对照。显示了VEGF/β-肌动蛋白或TSP-1/微管蛋白的相对比值。所有值都相对于相应的野生类型控件。(B类)凝血酶活化后对应于等量裂解血小板的血小板膜中VEGF和TSP-1的蛋白质印迹分析。2C1:tgC3G线；8A3:tgC3G∆Cat管线。定量不同基因型凝血酶刺激血小板中TSP-1（细胞质加膜）的总含量。值相对于相应的野生类型控件。细胞：细胞质，mbm：膜。
图4
图4。凝血酶或ADP激活的转基因血小板的释放促进HUVEC中毛细血管网络的形成
典型图像显示了HUVEC植入基底膜基质并辅以凝血酶释放物形成的毛细血管样结构(A类)或ADP-(B类)刺激血小板（补充释放剂后2:30小时）。比例尺：100μm。图形显示了在2到5小时内确定和平均的不同网络特性的平均值。主段由由两个连接点分隔的树组成，没有一个单独涉及一个分支（主连接点）。数据表示为每四份三个独立实验的平均值±SEM。*第页< 0.05.
图5
图5。血小板C3G调节体内血管生成：异位肿瘤在转基因小鼠中的生长增强
(A类)在wtC3G、tgC3G、wtC3G-ΔCat和tgC3GΔCat小鼠皮下注射Lewis肺癌细胞引起的肿瘤中细胞死亡延长。苏木精/伊红染色肿瘤切片的代表性光学显微镜图像显示细胞死亡区域(*). (B类)细胞死亡范围的量化表示为死亡细胞占肿瘤总面积的百分比。直方图表示平均值±SEM(n个=4适用于wtC3G和tgC3G；n个=3适用于重量C3GΔCat和重量C3G△Cat）。比例尺：2.5 mm(C类)来自指定基因型的3LL肿瘤切片的代表性图像，通过CD31染色显示血管密度。比例尺：20µm。血管数量的量化(D类)和容器尺寸(E类)在所示基因型的肿瘤切片中。分析每个肿瘤的3个代表性区域。与wtC3G小鼠的肿瘤相比，tgC3G小鼠中发生的（F至H）B16-F10黑色素瘤具有更大的肿块，且血管化程度更高。(F类)肿瘤肿块的量化(n个对于tgC3G＝7，n个=8（对于重量C3G）。(G公司)每个肿瘤3个代表区域的血管定量。所有值均对应于平均值±SEM(H（H）)B16-F10肿瘤切片的代表性图像显示CD31的免疫反应性。有血管用星号表示。比例尺：20µm。插图，图像放大显示一条血管，由箭头指示，用Chromo Map试剂盒+紫色对CD31进行染色。*第页< 0.05;**第页<0.01；***第页< 0.001.
图6
图6。血小板C3G有利于黑色素瘤转移
向TgC3G和wtC3G小鼠注射黑色素瘤B16-F10细胞。肿瘤细胞注射后15天取出肺部，并对表面转移进行量化。(A类)宏观图片（每组三个代表性示例）显示，与对照小鼠的肺部相比，tgC3G肺部的转移灶数量明显增加。(B类)两组均计算了每个肺的表面转移。图表显示了各组的平均转移数(n个=每个基因型4只小鼠）。*第页< 0.05. (C类)每个基因型的两只小鼠的代表性肺切片显示苏木精/伊红染色。箭头指向肺切片中的转移灶。比例尺：10µm。(D类)图中的值表示每个区域的肿瘤病灶数(n个=每组分析12个肺切片）。P（P）-显示了组之间的比较值。
图7
图7。C3G与tgC3G和tgC3G∆猫小鼠血小板中的Vamp-7相互作用
(A类)静息状态（Rest）和凝血酶（TH，0.2 U/mL）的C3G免疫沉淀在37°C搅拌下刺激血小板5分钟。免疫复合物中的Vamp-7用抗TI-Vamp抗体通过Western blot检测（Santa Cruz Biotechnologies，sc-67060）。使用每个基因型的4只小鼠的血小板细胞裂解物。b： 用琼脂糖珠培养的裂解液。(B类)用抗TI-VAMP和抗C3G抗体检测免疫复合物中C3G和VAMP-7的表达。L： 总细胞裂解物（50µg）。b： 裂解物与琼脂糖珠一起孵育。(C类)用HA标记的C3G构建物和所示的CFP-VAMP-7融合蛋白或空的pCDNA3-CFP-C4质粒（CFP）瞬时转染HEK293T细胞。用抗HA.11单克隆抗体免疫沉淀异位C3G，用抗C3G和抗TI-VAMP检测C3G和VAMP-7（箭头）。b： 琼脂糖珠与未转染的裂解物孵育。五十： 总细胞裂解物（50µg）。IP：用抗HA.11免疫沉淀。(D类)将pLTR2C3G∆Cat构建物或空pLTR2载体[33]与上述CFP-VAMP-7构建物一起瞬时转染HEK293T细胞。C3G用抗C3G抗体（IP）免疫沉淀，C3G和VAMP-7用抗C3G和抗GFP（圣克鲁斯生物技术公司，sc-9996）抗体检测。五十： 总细胞裂解物。VAMP7-NT：VAMP-7的N末端（长）结构域（氨基酸1-120）；VAMP7-CT：VAMP-7的C末端（SNARE）结构域（氨基酸121-188）；VAMP7-细胞：VAMP-7细胞溶质域（氨基酸1-188）。
图8
图8。TgC3G和TgC3GΔCat血小板在凝血酶激活后呈现较高的扩散区域，与较高水平的C3G-Vamp-7共定位相关
(A类)凝血酶刺激下血小板在聚赖氨酸涂层玻璃盖玻片上扩散的典型共焦显微镜图像。比例尺：5μm。图中显示了归一化为野生型血小板扩散面积的平均值±SEM。*第页< 0.05. 每个基因型平均检测48个血小板。(B类)用C3G（兔抗血清#1008[33]）和VAMP-7（抗SYBL1，Abcam，ab36195）抗体染色的扩散血小板颗粒的典型双免疫荧光共聚焦显微镜图像。比例尺：2µm。该图显示了C3G和Vamp-7之间同位化的Manders相关系数（平均值±SEM）。*第页< 0.05. 使用TgC3G 6A6线。
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