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.2018年3月；17(3):3722-3734.
doi:10.3892/mmr.2018.8371。 Epub 2018年1月2日。

利拉鲁肽修复梗死心脏：SIRT1/Parkin/有丝分裂途径的作用

乔慧英 1, 任海燕 2, 何都 三, 张敏芳 三, 熊晓芳 4, 吕荣 1
附属机构

利拉鲁肽修复梗死心脏：SIRT1/Parkin/有丝分裂途径的作用

乔慧莹等。 分子医学代表. 2018年3月.

缩回

摘要

利拉鲁肽是一种胰高血糖素样肽-1受体激动剂，用于治疗2型糖尿病患者。本研究旨在探讨利拉鲁肽在心肌梗死后梗死心脏修复中的作用及机制。本研究的结果表明，将利拉鲁肽的剂量增加约28天能够减少梗死后心脏的心肌纤维化、炎症反应和心肌死亡。在体外，利拉鲁肽保护心肌细胞线粒体免受慢性缺氧损伤，抑制线粒体凋亡途径。从机制上讲，利拉鲁肽提高了NAD依赖性蛋白脱乙酰化酶sirtuin‑1（SIRT1）的表达，从而增加了Parkin的表达，导致有丝分裂激活。保护性有丝分裂可逆转细胞内腺苷5'‑三磷酸的生成，减少细胞氧化应激，平衡氧化还原反应，维持线粒体内环境稳定。值得注意的是，在胰高血糖素样肽1受体被阻断或帕金被击倒后，利拉鲁肽对线粒体的有益作用消失。总之，本研究结果说明了利拉鲁肽通过调节SIRT1/Parkin/有丝分裂途径在修复梗死心脏中的保护作用。

关键词：利拉鲁肽；有丝分裂；帕金；NAD依赖性蛋白脱乙酰酶sirtuin-1；梗死心脏；细胞凋亡；线粒体。

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数字

图1。
图1。
利拉鲁肽修复梗死心脏。心肌梗死导致慢性心脏损害。梗死后连续28天通过尾静脉给予新制备的利拉鲁肽0.09 mg/kg（低剂量组）或0.18 mg/kg（高剂量组）。（A） 通过天狼星红染色评估心脏纤维化，（B）量化结果。利拉鲁肽以高（0.18 mg/kg）和低（0.09 mg/kg）剂量施用。（C） Western blotting检测心肌梗死后心肌纤维化的主要特征（D）TGFβ和（E）MMP9的表达。（F） TUNEL法用于评估梗死后28天心脏的凋亡率，并（G）对结果进行量化。（H-J）通过（H）western blotting检测梗死后28天心脏组织中凋亡蛋白表达的变化，并通过密度计分析（I）caspase3和（J）PARP的表达水平。（K） 应用TNFα免疫组化分析评价心脏炎症反应。评估（L）IL-6和（M）MCP1 mRNA表达的变化。放大倍数，×40*与假手术组相比P<0.05；#与PBS组相比，P<0.05。Lir，利拉鲁肽；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记；TGF公司β，转化生长因子-β; 基质金属蛋白酶9；劈开；聚ADP核糖磷酸聚合酶1；IL-6、IL-6；MCP1、C-C基序趋化因子2；TNF公司α，肿瘤坏死因子-α.
图2。
图2。
利拉鲁肽通过抑制线粒体凋亡减少心肌细胞死亡。H9C2缺氧模型在体外用于模拟慢性心脏损伤。H9C2细胞在缺氧条件下培养约48h。（A）MTT和（B）LDH检测细胞活力。利拉鲁肽能够在缺氧48小时下以剂量依赖的方式维持H9C2的活性*与对照组相比P<0.05；#与Lir（0 nM）组相比，P<0.05。由于在缺氧条件下显著提高H9C2存活率的利拉鲁肽的最低浓度为5 nM，因此该浓度用于以下实验。（C） 采用TUNEL法观察细胞凋亡，并给出（D）典型图像。Ex9-39是一种水溶性GLP-1受体拮抗剂，用于抑制利拉鲁肽的作用*与对照组相比P<0.05；#与缺氧组相比P<0.05；@与缺氧+Lir组相比，P<0.05。（E） 蛋白质印迹用于检测与线粒体凋亡相关的蛋白质表达的改变。（F） 定量Caspase3的蛋白表达。（G） cyt-c定位的免疫荧光分析。慢性缺氧导致细胞色素c从线粒体泄漏并转运至细胞核。定量（H）caspase9、（I）Bax和（J）c-IAP1的蛋白表达水平。利拉鲁肽能够降低凋亡蛋白的表达，Ex9-39逆转了这种作用*与对照组相比P<0.05；#与缺氧组相比P<0.05；@与缺氧+Lir组相比，P<0.05。Lir，利拉鲁肽；Ctrl，控制；克莱，劈开；乳酸脱氢酶；TUNEL，末端脱氧核苷酸转移介导的dUTP缺口末端标记；Ex9-39，exendin 9-39；Bax，凋亡调节因子Bax；c-IAP1，杆状病毒IAP重复表达蛋白2；细胞色素c、细胞色素c。
图3。
图3。
利拉鲁肽激活有丝分裂。（A） Western blotting用于测量有丝分裂相关蛋白表达的变化。（B） Parkin表达被量化。（C） 对线粒体和溶酶体进行共培养。在放大的面板中，橙色的免疫荧光显示线粒体自噬。慢性低氧刺激减少线粒体和溶酶体的病灶数量。然而，利拉鲁肽能够增加有丝分裂的证据，而Ex9-39则抵消了这种作用。（D） 对LC3II、（E）p62、（F）Atg5和（G）Beclin-1表达水平进行量化*与对照组相比P<0.05；#与缺氧组相比P<0.05；@与缺氧+Lir组相比，P<0.05。微管相关蛋白轻链；p62，固碳体-1；Atg5，自噬蛋白5；Ctrl，控制；Lir，利拉鲁肽；Ex9-39，exendin 9-39；线粒体。
图4。
图4。
利拉鲁肽通过帕金相关的有丝分裂保护线粒体功能。siRNA用于敲低利拉鲁肽处理的H9C2细胞中Parkin的表达。（A） 检测到ATP生成，利拉鲁肽以帕金依赖的方式保持ATP浓度。（B） 通过JC-1染色检测线粒体电位，并给出（C）代表性图像。红色荧光表示线粒体正常或健康，绿色荧光表示线粒体电位受损。（D） 通过流式细胞术检测细胞活性氧，并（E）对结果进行分析。检测到细胞抗氧化因子表达的变化。（F） 通过ELISA分析检测GSH、（G）MDA和（H）SOD浓度。（一） Caspase活性检测用于证明Parkin相关的有丝分裂在细胞凋亡中的作用*与对照组相比P<0.05；#与缺氧组相比P＜0.05；@与缺氧+Lir组相比，P<0.05。三磷酸腺苷；小干扰RNA；活性氧；Lir，利拉鲁肽；Ctrl，控制；谷胱甘肽；MDA、丙二醛；超氧化物歧化酶。
图5。
图5。
利拉鲁肽通过SIRT1通路激活Parkin。（A） Western blotting和（B）密度分析用于检测梗死心脏SIRT1的变化。利拉鲁肽能够以剂量依赖的方式维持SIRT1的表达水平。体外，分离总蛋白，并通过（C）蛋白质印迹进行分析，以测量（D）SIRT1和（E）Parkin表达的变化。对照组在缺氧条件下应用SIRT1激活剂SRT。SRT在缺氧刺激的情况下提高了SIRT1和Parkin的表达水平。SIRT1抑制剂Selisistat用于利拉鲁肽处理的细胞。Selissistat阻断了利拉鲁肽对SIRT1和Parkin表达的促进作用。（F） Caspase9活性和（G）LDH释放试验分别用于检测细胞活力和线粒体凋亡。（H） 共同训练SIRT1和Parkin。利拉鲁肽通过SIRT1增强Parkin表达水平。阻断SIRT1可抑制利拉鲁肽对Parkin的作用。相反，SIRT1的激活可逆转缺氧条件下Parkin表达的改变*与对照组相比P<0.05；#与缺氧组相比P<0.05；@与缺氧+Lir组相比，P<0.05。SIRT1，NAD依赖性蛋白脱乙酰酶sirtuin-1；SRT、SRT1720；Lir，利拉鲁肽；Ctrl，控制；LDH、乳酸脱氢酶。
图6。
图6。
利拉鲁肽通过激活SIRT1，通过帕金依赖性有丝分裂作用于梗死心脏的说明性模型。利拉鲁肽向SIRT1发出信号，SIRT1增强了细胞吞噬受体Parkin的表达。通过SIRT1/Parkin通路，利拉鲁肽激活有丝分裂，这对改善梗死心脏至关重要。保护性有丝分裂阻滞线粒体凋亡，促进心肌细胞存活。此外，有丝分裂可减轻氧化应激并保护线粒体功能。这些有益的作用可以减少心脏纤维化和炎症反应，从而改善梗死心脏。SIRT1，NAD依赖性蛋白脱乙酰酶sirtuin-1。
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