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比较研究
.2018年3月;52(3):787-803.
doi:10.3892/ijo.2018.4236。 Epub 2018年1月4日。

MYCN扩增的IMR-32人神经母细胞瘤细胞中上调的致瘤蛋白促进增殖和迁移

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比较研究

MYCN扩增的IMR-32人神经母细胞瘤细胞中上调的致瘤蛋白促进增殖和迁移

哈亚特·扎亚蒂等。 国际癌症杂志. 2018年3月.

摘要

儿童神经母细胞瘤是影响儿童的最常见的颅外癌类型之一,临床范围从自发性退化到恶性和致命性进展。为了改善高危神经母细胞瘤儿童的临床疗效,了解其恶性行为的致瘤机制至关重要。MYCN原癌基因bHLH转录因子扩增与侵袭性、高危神经母细胞瘤的恶性、治疗侵袭性有关。在本研究中,我们使用SILAC方法比较了MYCN扩增的IMR-32和非MYCN-扩增的SK-N-SH人类神经母细胞瘤细胞的蛋白质组特征。与SK-N-SH细胞相比,IMR-32中的致瘤蛋白(包括脂肪酸结合蛋白5(FABP5)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、含有5[BIRC5(survivin)]的杆状病毒IAP重复序列和高迁移率组蛋白A1(HMGA1))被发现显著上调,并映射到高致瘤途径,包括MYC、,MYCN、微管相关蛋白Tau(MAPT)、E2F转录因子1(E2F1)、固醇调节元件结合转录因子1或2(SREBF1/2)、低氧诱导因子1α(HIF-1α)、Sp1转录因子(Sp1)和淀粉样前体蛋白(APP)。MYCN、HMGA1、FABP5和L1-CAM的转录敲除(KD)在转染后48小时显著抑制IMR-32细胞的增殖。与对照组相比,FABP5和MYCN被敲除的IMR-32细胞的早期凋亡率显著升高,而FABP5与HMGA1 KD显著消除了细胞迁移。值得注意的是,L1-CAM、HMGA1和FABP5 KD同时下调MYCN蛋白表达和MYCN-KD同时降低L1-CAM,HMGA1及FABP5蛋白表达,而survivin蛋白表达则显著下调MYCN、HMGAl及FABP5KD。此外,L1-CAM和FABP5-KD联合使用导致HMGA1蛋白表达的下调。总的来说,我们的数据表明,MYCN与恶性IMR-32细胞中上调的高致瘤蛋白之间的这种相互作用可能助长了它们的攻击行为,从而表明联合、多模式靶向治疗对根除这种致命的儿童癌症的重要性。

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作者声明,他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
蛋白质组学数据的验证。(A) 与SK-N-SH细胞相比,IMR-32中L1细胞粘附分子(L1-CAM)、MYCN原癌基因、bHLH转录因子(MYCN)、高迁移率组蛋白A1(HMGA1)、survivin和脂肪酸结合蛋白5(FABP5)蛋白表达的代表性western blot图像。(B) 密度分析验证了蛋白质组学数据,并显示与SK-N-SH细胞相比,IMR-32中L1-CAM、MYCN、HMGA1、survivin和FABP5的显著过度表达。实验一式三份,重复3次以上。结果表示平均值±SEM;*P<0.05和**P<0.01。
图2
图2
IMR-32细胞中定位于MYCN原癌基因bHLH转录因子途径的致瘤蛋白显著上调。(A) STRING通路分析揭示了IPA预测的IMR-32细胞中激活的上游调节因子分子之间的相互作用。重要的是具有枢纽(多边缘,红圈)的各种蛋白质,包括Sp1转录因子(Sp1)、MYC、MYCN、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、高迁移率组蛋白A1(HMGA1)、INSR、KIT配体(KITLG)、甾醇调节元件结合转录因子2(SREBF2)和SREBF1。(B) STRING通路分析还侧重于HMGA1、MYCN和BIRC5映射到的激活上游调节器之间的强相互作用。特别令人感兴趣的是与一个或多个验证目标相关的枢纽,包括MYCNs、MYC、SP1、HIF-1α、SREBF1、BIRC5、HMGA1和INSR。
图3
图3
新的途径将IMR-32细胞中受MYCN原癌基因、bHLH转录因子影响的蛋白质与恶性肿瘤联系起来。(A) STRING通路分析显示,MYCN、BIRC5、高迁移率组蛋白A1(HMGA1)与细胞有丝分裂和增殖因子AURKA/B、细胞周期依赖性激酶1(CDK1)、CDCA8和INCENP之间存在非常强的相互作用;(B) 而L1细胞粘附分子(L1-CAM)与神经细胞粘附分子1(NCAM1)、神经胶质蛋白1(NRP1)、NCAN、接触蛋白2(CNTN2)、RANBP1和表皮生长因子受体(EGFR)等表现出很强的相互作用,其中大多数是血管生成标记物。
图4
图4
致瘤蛋白的转录敲低显著降低了蛋白的表达。(A) 靶向L1-cell粘附分子(L1-CAM)、高迁移率组蛋白A1(HMGA1)、MYCN原癌基因、bHLH转录因子(MYCN)和脂肪酸结合蛋白5(FABP5)的siRNA瞬时转染消除了它们的蛋白表达。(B) 多个实验重复的密度分析显示,与对照siRNA转染细胞相比,上述蛋白的表达显著降低。实验一式三份,重复3次以上。结果表示平均值±SEM;*P<0.05和**P<0.001。
图5
图5
转录敲除实验揭示了致瘤蛋白之间的相互作用。(A) Western blot分析显示,在L1细胞粘附分子(L1-CAM)、高迁移率组蛋白A1(HMGA1)和脂肪酸结合蛋白5(FABP5)被击倒后,MYCN原癌基因、bHLH转录因子(MYCNs)蛋白表达显著下调与对照组相比,IMR-32细胞中的siRNA。(B) 相反,siRNA敲除MYCN导致L1-CAM、HMGA1和FABP5蛋白表达的同时显著下调,而(C)siRNA联合敲除L1-CAM和FABP五导致HMGA1蛋白表达同时显著下调。(D) MYCN、HMGA1和FABP5基因敲除以及联合双靶点敲除导致survivin蛋白表达的同时下调。将western blot实验的非相邻条带并排重新对齐,以提高所呈现数据的清晰度,并用直线表示。实验一式三份,重复3次以上。结果表示平均值±SEM;*P<0.05和**P<0.01。
图6
图6
致瘤蛋白的转录敲除抑制IMR-32细胞的增殖和迁移。(A) 与对照组相比,瞬时siRNA转染和敲除MYCN原癌基因、bHLH转录因子、L1-cell粘附分子、高迁移率组蛋白A1(HMGA1)和脂肪酸结合蛋白5(FABP5)蛋白表达导致IMR-32细胞增殖在48-96小时显著降低,通过WST-1细胞增殖试验测定。(B) 与对照组相比,双siRNA靶向敲除(MYCN+L1-CAM、MYCN+HMGA1、MYCD+FABP5、L1-CAM+HMGA1,L1-CAM+FABP5和HMGA1+FABP4)也导致48–96小时内IMR-32细胞增殖率显著降低。(C) “伤口闭合”的典型图像显示,受到FABP5和HMGA1 siRNA敲除的IMR-32细胞的迁移能力降低。(D) 使用AxioVision系统软件测量的多个随机场中“伤口闭合”的平均面积表明,与对照组相比,IMR-32细胞迁移在统计学上显著减少。实验一式三份,重复3次以上。结果表示平均值±SEM;*P<0.05。
图7
图7
MYCN原癌基因、bHLH转录因子(MYCN)和脂肪酸结合蛋白5(FABP5)的转录下调诱导IMR-32细胞凋亡。(A) 用Annexin V/碘化丙啶(PI)细胞凋亡分析和流式细胞术分析测定,转染和对照IMR-32细胞的MYCN、L1-cell粘附分子(L1-CAM)、高迁移率组蛋白A1(HMGA1)和FABP5 siRNA-转染后48小时的晚期细胞凋亡率没有显著差异。(B) 转染后48小时,MYCN和FABP5 siRNA-转染IMR-32细胞的早期凋亡率显著高于对照组(分别为~27%和~29%,而约17%)。(C) 转染后48小时用Annexin V(红色)和PI(绿色)染色的MYCN和FABP5 siRNA转染细胞的荧光显微镜图像。实验分三次进行,重复3次以上。结果表示平均值±SEM。

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