Nerve growth factor upregulates sirtuin 1 expression in cholestasis: a potential therapeutic target

doi:10.1038/emm.2017.235

.2018年1月12日；50（1）：e426。

doi:10.1038/emm.2017.235。

神经生长因子上调胆汁淤积症中sirtuin 1的表达：一个潜在的治疗靶点

蔡明石^1 2, 李伯黄¹, Cheuk-Kwan Sun公司^三, Ting-Chia Chiu公司¹, 林玉春¹, I-Wei Chang公司⁴, 陈伯翰^三, 英仙高^三

附属公司

¹台湾高雄义寿大学易达医院外科。
²台湾高雄义寿大学糖化后医学院。
^三台湾高雄义寿大学易达医院医学研究部。
⁴台湾高雄义寿大学易达医院病理科。

PMID： 29328070
预防性维修识别码：项目编号5799797
内政部： 2017.235年10月18日

神经生长因子上调胆汁淤积症中sirtuin 1的表达：一个潜在的治疗靶点

蔡明善等。实验-分子-药物. 2018.

.2018年1月12日；50（1）：e426。

doi:10.1038/emm.2017.235。

作者

蔡明善^1 2, 李伯黄¹, Cheuk-Kwan Sun公司^三, Ting-Chia Chiu公司¹, 林玉春¹, I-Wei Chang公司⁴, 陈伯翰^三, 英仙高^三

附属公司

¹台湾高雄义寿大学易达医院外科。
²台湾高雄义寿大学糖化后医学院。
^三台湾高雄义寿大学易达医院医学研究部。
⁴台湾高雄义寿大学易达医院病理科。

PMID： 29328070
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内政部： 2017.235年10月18日

摘要

本研究探讨了神经生长因子（NGF）在胆汁淤积性肝脏SIRT1表达中的调节作用。我们在胆管结扎（BDL）小鼠模型中评估了肝结石患者肝脏中NGF及其同源受体的表达，以及NGF治疗对肝损伤和肝脏SIRT1表达的影响。组织病理学和分子分析表明，与非肝结石肝脏相比，人类疾病肝脏的肝细胞表达NGF、proNGF（NGF的前体）、TrkA和p75NTR，而肝结石中只有p75NTR上调。在未经NGF治疗的BDL模型中，p75NTR（而非TrkA拮抗剂）显著加重了BDL诱导的肝损伤。相反，在接受NGF治疗的动物中，NGF的肝保护作用仅通过TrkA而不是通过p75NTR拮抗来消除。有趣的是，在人类肝脏中发现肝脏SIRT1与NGF表达呈正相关。体外研究表明，NGF上调小鼠肝脏、人类Huh-7和啮齿动物肝细胞中SIRT1的表达。NGF和proNGF均对过氧化氢诱导的Huh-7细胞毒性产生保护作用，而抑制TrkA和p75NTR活性可防止氧化细胞死亡。从机制上讲，NGF（而非proNGF）通过核因子（NF）-κB活性上调了人类Huh-7和啮齿动物肝细胞中SIRT1的表达，而NGF诱导的磷脂酰肌醇-3激酶/Akt、细胞外信号调节激酶、NF-κB信号传导和SIRT1活性参与了其对氧化损伤的肝保护作用。这些发现表明，对NGF/SIRT1轴的药理操作可能是治疗胆汁淤积性疾病的一种新方法。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
NGF、proNGF及其同源受体TrkA和p75NTR在肝结石患者肝脏中的表达。(一)肝结石样本(n个=5）包括结石和对侧肝组织。肝细胞癌患者的平行蛋白提取物为非肝结石对照组（NHC，n个=4），并对NGF、proNGF、TrkA和p75NTR水平进行western blotting检测。NHC组和肝结石组的扫描密度数据分别显示在补充表S3和S4中。NGF和proNGF表达水平的密度分析(b条)以及TrkA和p75NTR的(**c（c）**)，表示为它们与内部肌动蛋白控制的比值的平均值±标准差**P（P）*<0.05 vs NHC水平，^#*P（P）*<0.05 vs对侧水平。(d日)RT-qPCR检测肝结石患者肝脏中NGF、TrkA和p75NTR mRNA水平。Spearman对肝脏NGF关系的相关分析(**e（电子）**)和促NGF表达(**（f）**)血清总胆红素水平。

图2
肝结石患者肝实质肝细胞中NGF、proNGF及其同源受体TrkA和p75NTR的组织学定位。肝结石的肝切片和肝结石肝组织的对侧部分(n个=5）和肝细胞癌肝旁切片(n个=4）非肝结石对照组（NHC）接受福尔马林固定、组织处理和石蜡包埋程序。组织切片进行NGF、proNGF、TrkA和p75NTR免疫组织化学染色。比例尺=100 微米。箭头表示结石组织中典型的脂肪变化，而白色和黑色箭头分别表示肝细胞和浸润细胞中的免疫反应信号。

图3
TrkA和p75 NTR阻断剂对胆管结扎（BDL）诱导的小鼠肝损伤的影响。接受BDL手术的ICR小鼠腹腔注射重组NGF(n个=6）每周两次或PBS(n个=6），GW441756（GW；n个=6），二甲基亚砜(n个=3）或PD90780（PD；n个=6）每天。术后14天，血清AST水平(一)，ALT（高度）(b条)和总胆红素(**c（c）**)生化检测，而肿瘤坏死因子（TNF）-α(d日)和白细胞介素（IL）-6(**e（电子）**)用ELISA法检测血清中的水平。BDL致胆汁淤积性损伤小鼠或同时治疗小鼠的H&E染色结果显示肝坏死区呈虚线圆圈(**（f）**)，通过形态计量分析进行定量(克). 比例尺=1000 微米。所有数据均显示为平均值±s.e.m.ND，无法检测。NS，不显著**P（P）*所示组之间<0.05。

图4
TrkA和p75 NTR阻滞剂对胆管结扎（BDL）诱导的实质性肝细胞PARP裂解和凋亡的影响。接受BDL手术的小鼠腹腔注射重组NGF(n个=6）每周两次或PBS(n个=6），GW441756（GW；n个=6），二甲基亚砜(n个=3）或PD90780（PD；n个=6）每天。治疗2周后，对各组的混合肝提取物进行western blotting，以检测caspase-3和PARP的前肽和裂解形式(一). 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3激活的密度分析(b条)和PARP(**c（c）**)，表示为卵裂与前肽含量的比率，然后是归一化到阴性对照（NC）水平。PARP活性肽的IHC染色(d日)和标签索引(**e（电子）**)定量证明PD90780的给药增强了BDL处理小鼠肝脏中PARP激活的增加。(**（f）**)TUNEL染色的代表性显微照片显示了小鼠肝脏切片中的凋亡事件。比例尺=50 微米。(克)对TUNEL阳性实质细胞的分析表明，重组NGF给药具有保护作用，而用p75NTR拮抗剂PD90780治疗会增加BDL诱导的胆汁淤积性损伤肝脏的凋亡细胞死亡。所有数据均显示为平均值±标准误差**P（P）*所示组之间<0.05。ND，无法检测。NS，不显著。

图5
同时给予NGF及其受体阻滞剂对胆管结扎（BDL）诱导的小鼠肝损伤的影响。接受BDL手术的ICR小鼠腹腔注射重组NGF（1 毫克公斤⁻¹；n个=3）每周两次，每天同时注射PBS(n个=6），GW441756（GW；1 毫克公斤⁻¹；n个=6），二甲基亚砜(n个=6）或PD90780（PD；1 毫克公斤⁻¹；n个=6）。术后14天，血清AST水平(一)和总胆红素(b条)生化检测，而血清白细胞介素（IL）-6水平(**c（c）**)ELISA分析。(d日)代表性的H&E染色结果显示胆汁淤积损伤肝脏的坏死区域。比例尺=1000 微米。(**e（电子）**)坏死区域的形态分析。所有数据均显示为平均值±标准误差**P（P）*所示组之间<0.05。ND，未检测到。NS，不显著。

图6
同时给予NGF及其受体阻滞剂对胆管结扎（BDL）诱导的实质性肝细胞凋亡的影响。接受BDL手术的ICR小鼠腹腔注射重组NGF（1 毫克公斤⁻¹；n个=3）每周两次，每天同时注射PBS(n个=6），GW441756（GW；1 毫克公斤⁻¹；n个=6），二甲基亚砜(n个=6）或PD90780（PD；1 毫克公斤⁻¹；n个=6）。治疗2周后，对各组的混合肝提取物进行western blotting，以检测caspase-3和PARP的前肽和裂解形式(一). 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的激活(b条)和PARP(**c（c）**)进行了密度分析，并显示为劈裂-前肽比率，并归一化为阴性对照（NC）水平。(d日)小鼠肝脏激活PARP的IHC染色代表性图像。(**e（电子）**)PARP活化的定量测量如标记指数所示。(**（f）**)TUNEL染色的代表性显微照片显示了小鼠肝脏切片中的凋亡事件。比例尺=50 微米。(克)TUNEL阳性实质细胞的分析表明，GW治疗显著增加了BDL诱导的胆汁淤积性损伤肝脏的凋亡细胞死亡。所有数据均显示为平均值±标准误差**P（P）*所示组之间<0.05。ND，未检测到。NS，不显著。

图7
SIRT1在人肝结石和小鼠淤胆肝中的表达。(一)Western blotting检测人类非肝结石对照组（NHC，n个=4），以及人类肝结石病肝脏中的结石和对侧区域(n个=5). NS，不显著。(b条)RT-qPCR检测肝结石患者肝脏中SIRT1 mRNA。所有数据均显示为平均值±标准误差**P（P）*与NHC相比<0.05。(**c（c）**)Spearman对所有人类肝脏标本的相关性分析表明，肝脏SIRT1与NGF/proNGF表达呈正相关。(d日)SIRT1 IHC染色显示SIRT1肽在人NHC和肝结石肝细胞中的核质定位。钢筋=200 微米。(**e（电子）**)在胆管结扎（BDL）手术诱导的胆汁淤积性肝损伤小鼠模型中，NGF治疗上调SIRT1并通过NGF中和抗体消除SIRT1。在BDL手术后14天收集小鼠肝脏。(**（f）**)对接受BDL手术、随后给予NGF或生理盐水14天的小鼠肝脏进行SIRT1 IHC染色。条形=100 微米。

图8
氧化应激下肝细胞中NGF诱导SIRT1上调的参与。(一)Huh-7肝细胞用NGF或proNGF处理24小时 h.Western blotting检测表明，NGF而非proNGF上调了人肝细胞中SIRT1的表达。(b条)NGF刺激培养的大鼠和小鼠原代肝细胞SIRT1上调。(**c（c）**)NGF介导的信号激活动力学曲线。Huh-7细胞用NGF处理指定时间，并用western blotting测定。(d日)NF-κB和SIRT1活性参与NGF诱导的SIRT1上调。Huh-7细胞用10 μM（M）PDTC或20 2μM EX-527 h、然后是2或24 NGF刺激h。(**e（电子）**)NGFR阻滞剂、激酶抑制剂和SIRT1调节剂对氧化应激激活的促凋亡机制的影响。Huh-7细胞用20 μM（M）白藜芦醇（RSV；SIRT1激动剂）或与10 纳克毫升⁻¹24小时NGF 10时为h μM（M）NGFR阻断剂（GW441756和PD90780），10 μM（M）激酶阻滞剂（PDTC、LY294002和PD98059），20 μM（M）EX-527（SIRT1拮抗剂）或等效DMSO，然后短暂暴露于0.8 米M（M）H（H）₂O（运行）₂H之后₂O（运行）₂除去并再孵育4小时，收集蛋白质裂解物用于胱天蛋白酶-3和PARP的蛋白质印迹检测。密度分析数据如补充图S6所示。(**（f）**)通过基于MTT的细胞活性测定测定NGFR阻滞剂、激酶抑制剂和SIRT1调节剂对氧化应激诱导的肝毒性的影响。所有数据均显示为三个独立实验的平均值±标准差**P（P）*与二甲基亚砜溶剂对照组或指定组之间<0.05；^#*P（P）*<0.05与H₂O（运行）₂治疗组。

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