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.2018年1月11日；553(7687):222-227.
doi:10.1038/nature25171。 Epub 2018年1月3日。

FGFR3-TACC3基因融合在肿瘤中的代谢功能

弗拉蒂尼（Véronique Frattini） 1, 斯特凡诺·帕格诺塔 1 2, 塔拉 1, 杰瑞·J·范 三 4, 马可·V·拉索 1, 桑贝·李 1, 卢西亚诺·加罗法诺 1 2 5, 张静（音译） 1, 培果石 1, 杰纳维夫·刘易斯 1, 海洛伊斯·桑森 1, 瓦妮莎·弗雷德里克 1, 安吉丽卡·M·卡斯塔诺 1, 路易吉·塞鲁洛 2 5, Delphine C M Rolland公司 6, Raghvendra购物中心 7, 卡里玛·莫赫塔里 8 9 10, Kojo S J Elenitoba-Johnson公司 6, 马克·桑森 8 10 11, 西黄 三 4, 米歇尔·塞卡雷利 2 5, 安娜·拉索雷拉 1 12 13, 安东尼奥·伊瓦隆 1 12 14
附属公司

FGFR3-TACC3基因融合在癌症中的代谢功能

维罗妮克·弗拉蒂尼等。 自然. .

摘要

染色体易位产生框架内致癌基因融合是靶向癌症治疗成功的显著例子。我们之前在3%的人类胶质母细胞瘤病例中描述了FGFR3-TACC3（F3-T3）的基因融合。随后的研究报告显示，F3-T3在许多其他癌症中的频率相似，表明F3-T_3是所有肿瘤类型中常见的融合。F3-T3融合是一种有效的致癌基因，对FGFR抑制剂具有敏感性，但下游致癌信号通路尚不清楚。在这里，我们显示F3-T3融合的人类肿瘤聚集在以线粒体功能激活为特征的转录亚群中。F3-T3激活氧化磷酸化和线粒体生物生成，并诱导对氧化代谢抑制剂的敏感性。磷酸肽PIN4的磷酸化是线粒体代谢激活信号通路中的中间步骤。F3-T3-PIN4轴触发过氧化物酶体的生物生成和新蛋白质的合成。合成代谢反应通过产生细胞内活性氧物种收敛于PGC1α辅活化子，从而促进线粒体呼吸和肿瘤生长。这些数据说明了F3-T3参与的致癌回路，并表明F3-T3-阳性肿瘤依赖于线粒体呼吸，强调了这一途径是F3-T3融合治疗肿瘤的一个治疗机会。我们还提供了对启动癌症线粒体代谢的代谢反应链的基因改变的见解。

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数字

扩展数据图1
扩展数据图1。F3-T3激活有丝分裂和线粒体
一、用二甲基亚砜或PD173074、HA-F3-T3-K508M和HA-vector处理的HA-F3-T_3中FGFR3和p-FGFR3的免疫印迹分析。β-actin显示为负荷控制。实验重复至少五次，结果相似。b条，PD173074处理的HA-F3-T3、HA-F3-T_3、HA-vector和HA-F3-T3-K508M之间的相关性热图。上部和右侧轨道颜色表示样本类型；左轨道色标表示每个样本与F3-T3组之间的相关性。HA-F3-T3、HA-F3-T3-PD173074（每组n=5个生物独立样本）。HA-vector和HA-F3-T3-K508M（每组3个生物独立样本）。c（c），GO类别的丰富地图网络得分显著(问-三个独立的基因集富集分析（F3-T3与F3-T3-PD173074、F3-T3-与F3-T_3-K508M、F3-T_3与载体）中，每次比较的值<10E-6，NES>0.6，双侧Mann-Whitney-Wilcoxon检验）。节点表示GO术语，线条表示其连接性。节点的大小与富集显著性成正比，线条的厚度表示组间共享基因的比例。d日，qRT–用载体（DMSO）或PD173074处理HA-vector或HA-F3-T3 12小时后的PCR。数据是两个独立实验中一个代表性实验相对于载体（虚线）的折叠变化（数据是平均值 ± s.d.，n=3个技术复制品）。P（P）-使用双尾t吨-检验，不等方差。电话： * <0.05; **<0.01; ***<0.001之间。有关完整列表P（P）-值引用Excel源数据。e（电子），通过MitoTracker FACS分析HA-F3-T3、F3-T3-K508M或载体中的线粒体质量（左侧面板）。右侧面板，MFI量化。数据为三个（矢量和F3-T3）和两个（F3-T3-K508M）独立实验的平均值±标准差；电话： * <0.05; **<0.01，双尾t吨-检验，不等方差。（f）、HA-F3-T3、HA-F3-T3-K508M和HA-vector中线粒体蛋白的免疫印迹分析。实验被独立重复三次，结果相似。克，mGSC-F3-T3-sh中VDAC1和NDUFS4免疫荧光的代表性显微照片（上面板，绿色）TP53型和mGSC-HRAS-12V-shTP53型细胞核的DAPI染色显示为细胞密度的指示（下面板，蓝色）。实验独立重复两次，结果相似。分子量显示在所有免疫印迹上。
扩展数据图2
扩展数据图2。F3-T3诱导对线粒体代谢抑制剂的敏感性
一，使用HA-vector、HA-F3-T3或HA-F3-T3-K508M中的FGFR3抗体进行免疫印迹分析。α-微管蛋白作为负载对照。实验重复五次，结果相似。b条在AZD4547存在或不存在的情况下，GSC1123的OCR窝藏F3-T3。数据为两个独立实验中一个代表性实验的平均值±标准差（n=6个技术复制品）。电话：<0.001，对于比率1-4和9-12，双尾t吨-检验，不等方差。c（c）在AZD4547、F3-T3-K508M或空载体存在或不存在的情况下，表达F3-T3的RPE细胞的OCR。数据为三个独立实验中的一个代表性实验的平均值±标准差（n=3个技术复制品），三个独立试验一式三份，结果相似。电话：对于比率1-4，<0.05；电话：<0.001，对于比率9–12，双尾t吨-检验，不等方差。d日、表达F3-T3、F3-T3-K508M的U251的OCR或存在或不存在AZD4547的空载体。数据为两个独立实验中的一个代表性实验的平均值±标准差（n=3个技术复制品），两个实验一式三份，结果相似。电话： <比率1-4为0.01；电话：<0.001，对于比率9–12，双尾t吨-检验，不等方差。e（电子）HA-F3-T3、F3-T3-K508M或空矢量的ECAR。数据为两个独立实验中的一个代表性实验的平均值±标准差（n=3个技术复制品），两个实验一式三份，结果相似。电话：<0.01，比率9–12，双尾t吨-检验，不等方差。（f）HA-F3-T3、HA-F3-T3-K508M或HA-vector中OCR（率4）与ECAR（率8）的比值；数据为两个独立实验的平均值±标准差（n=6次重复），每个实验重复三次。电话：<0.01，双尾t吨-检验，不等方差。克用指示浓度的寡霉素处理72小时后，定量HA-F3-T3或HA-vector中ATP的生成。数据是独立的技术复制品（n=4）和具有类似结果的两个独立实验中一个代表性实验的平均值（连接线）。电话：**<0.01; ***<0.001; 双尾t检验不等方差。小时，HA-F3-T3或HA-vector在葡萄糖（25 mM）或半乳糖（25 mC）存在或不存在寡霉素（100 nM）的情况下培养的细胞生长的时间进程分析。数据是两个具有类似结果的独立实验中一个代表性实验的独立技术复制品（n=3）。电话：***<0.001; 双尾t检验，不等方差。我，mGSC-F3-T3-sh的存活率TP53型和mGSC-HRAS-12V-shTP53型用溶媒或二甲双胍治疗72小时，j个、鱼藤酮、，k个，甲萘醌的指示浓度。数据为两个具有类似结果的独立实验中一个代表性实验的平均值±标准差（n=3个技术复制品）。电话：**<0.01; ***<0.001; 双尾t检验，不等方差。我mGSC-F3-T3-sh中COX1和COX2蛋白的Western blot分析TP53型和mGSC-HRAS-12V-shTP53型用浓度为8μM的赋形剂或替加环素处理72小时；α-微管蛋白显示为负荷控制。实验独立重复两次，结果相似。米，mGSC-F3-T3-sh中细胞ATP的定量TP53型（左侧条形图）和mGSC-HRAS-12V-shTP53型（右侧条形图）用赋形剂或二甲双胍（1mM）、替加环素（8μM）或甲萘二酮（5μM）处理16小时。数据为一个实验的平均值±标准差（n=6个技术重复）。电话：**<0.01; ***<0.001; 双尾t检验，不等方差。n个，mGSC-F3-T3-sh的量化TP53型对照组和替加环素治疗组小鼠的肿瘤体积。数据为治疗第6天的肿瘤体积（四分位范围的中位数），此时所有小鼠仍在研究中；n=8，用于控制（中值=1427mm三)替加环素治疗小鼠的n=10（中位数=843.4mm三);电话：*<0.05; 双边Mann-Whitney检验。分子量用免疫印迹法表示。
扩展数据图3
扩展数据图3。F3-T3催化PIN4的Tyr-122磷酸化
一，PIN4（红色）的Tyr-122两侧的氨基酸序列在进化上是保守的。b条、HA-F3-T3或F3-T3-K508M的免疫沉淀western blot分析，有无内源性沉默PIN码4β-actin显示为负载控制。WCL，全细胞裂解物。c（c），使用所示抗体对表达空载体FGFR3、F3-T3或F3-T3-K508M的U87胶质瘤细胞的磷酸酪氨酸免疫沉淀物进行免疫印迹分析（左侧面板）。WCL，右侧面板。星号表示非特定带。d日，使用所示抗体对表达空载体F3-T3或F3-T3-K508M的HA磷酸酪氨酸免疫沉淀物进行免疫印迹分析（左侧面板）；WCL，右侧面板。FAK显示为加载控制。e（电子），对含有内源性F3-T3的GSC1123磷酸酪氨酸免疫沉淀物的免疫印迹分析显示，在AZD4547治疗指定时间后，F3-T3-底物的磷酸化降低（左面板）；WCL，右侧面板。Paxillin显示为加载控件。（f），对用AZD4547处理指定时间的GSC1123中典型FGFR信号蛋白进行免疫印迹分析。β-actin显示为负荷控制。克、用WT或不可磷酸化（Y/A）F3-T3激酶底物突变体转导的HA-F3-T3或HA-vector中磷酸酪氨酸免疫沉淀物的免疫印迹分析。Paxillin显示为加载控件。星号表示非特定带区。小时，使用载体或F3-T3转导的HA中pY122-PIN4特异性抗体（红色）进行免疫荧光染色的共焦图像，无内源性沉默或沉默PIN码4用DAPI（蓝色）对细胞核进行染色。我用FGFR3、F3-T3、F3-T_3-K508M或空载体转导的SF126细胞中pY122-PIN4、总PIN4和FGFR3的免疫印迹分析。β-actin显示为负荷控制。所有面板中都显示了分子量。中的实验b条-克、和我独立重复三次，结果相似。中的实验小时以相似的结果独立重复四次。
扩展数据图4
扩展数据图4。F3-T3激酶底物酪氨酸磷酸化的功能分析
一，mGSC-F3-T3-sh磷酸酪氨酸免疫沉淀的蛋白质印迹分析TP53型和mGSC-HRAS-12V-shTP53型使用PIN4抗体。F3-T3和RAS-12V表达如图所示。α-微管蛋白显示为负荷控制b条，mGSC-F3-T3-sh肿瘤中使用pY122-PIN4特异性抗体（红色，上面板）的免疫荧光显微照片TP53型和mGSC-HRAS-12V-shTP53。用DAPI（蓝色下面板）对细胞核进行复染。实验独立重复两次，结果相似。c（c），F3-T3-阳性（上面板）和F3-T3阴性（下面板）GBM中pY122-PIN4免疫荧光的代表性显微照片（绿色）。右侧面板显示pY122-PIN4-DAPI联合染色的放大倍数较高，描绘了pY122-PIN4的细胞质定位。细胞核的DAPI染色显示为细胞密度的指示（中间面板）。d日分析用WT转导的HA-F3-T3或GOLGIN84、C1ORF50和DLG3的不可磷酸化突变体（Y/A）的OCR。HA-vector作为控件包含在内。数据为两个独立实验中的一个代表性实验的平均值±标准差（n=5个技术重复），两个独立实验一式三份，结果相似。P（P）<0.001，矢量与每个F3-T3组合的比率为9–12，双尾t吨-检验，不等方差。e（电子），PKM2-WT、PKM2-Y105A或空载体转导的HA-F3-T3的OCR分析。HA-vector作为控件包含在内。数据为三个独立实验中一个代表性实验的平均值±标准差（n=3个技术复制品）；P（P）<0.001，矢量与每个F3-T3组合的比率为9–12，双尾t吨-检验，不等方差。（f），HA-F3-T3或HA-载体中GOLGIN84、C1ORF50和DLG3 WT或Y/A突变体的免疫印迹分析。克用F3-T3或空载体转导HA进行免疫印迹分析，以表达PKM2 WT或PKM2-Y105A。小时用F3-T3或空载体转导HA进行免疫印迹分析，以表达PIN4 WT或PIN4-Y122F。我内源性沉默后表达F3-T3的HA中PIN4蛋白的免疫印迹分析PIN码4并用PIN4 WT、PIN4-Y122A或PIN4-Y122F重新组装。在（f）-我β-actin显示为负荷控制。分子量显示在所有免疫印迹上。j个，HA中ATP水平的量化我数据为两个独立实验中一个实验的平均值±标准差（n=4个技术复制品）。电话：*<0.05; **<0.01; ***<0.001; 双尾t检验，不等方差。中的实验一,（f）-我独立重复三次，结果相似。
扩展数据图5
扩展数据图5。F3-T3融合阳性和融合样GBM的转录组学分析以及使用不同致癌改变验证eeMWW
一基于9个F3-T3融合阳性GBM中最高和最低上调或下调概率的前50个基因和后50个基因，在欧氏距离矩阵上进行共识聚类。共识矩阵是使用544个样本中的70%从10000个随机抽样中获得的。9个F3-T3阳性GBM（红色）属于一个簇（青色）。b条、F3-T3阳性GBM中“Hallmark氧化磷酸化”GO类别的Mann-Whitney-Whilcoxon富集图、NES和P（P）-显示值。c（c）、具有统计意义的GO类别的丰富地图网络(问-值<0.001，NES>0.6，双侧Mann-Whitney-Whilcoxon检验）。节点表示GO项，线条表示其连通性。节点的大小与类别中的基因数量成正比，线条的粗细表示组之间共享的基因的比例。d日，拷贝数放大分析POLRMT公司基因比较融合样GBM和所有其他GBM在不同阈值下的扩增检测，以检测SNP阵列的log-R比率。P（P）-指出了不同阈值下的值和对数比值（Fisher精确检验）。e（电子）,POLRMT公司融合样GBM（n=9）和其余样本（n=535）中的基因表达。方框图跨越第一个四分位到第三个四分位数，晶须显示1.5×四分位范围。P（P）-值，双侧Mann-Whitney-Whilcoxon试验。（f），F3-T3阳性（绿色，左侧面板）和F3-T3-阴性（右侧面板）GBM中VDAC1免疫荧光的代表性显微照片。细胞核的DAPI染色显示为细胞密度的指示（蓝色，下方面板）。克，对544个样本中含有KRAS突变（红色）的2个GBM进行分层聚类。2个KRAS突变样本的热图放大到左侧。小时，BRCA队列中5个KRAS突变样本（红色）的层次聚类（n=1093）。我，544个样本中6个EGFR-SEPT14阳性GBM（红色）的分层聚类。中的数据克-我使用欧几里德距离和Ward连锁方法获得，分别基于上调或下调概率最高和最低的前50个和后50个基因。
扩展数据图6
扩展数据图6。F3-T3融合阳性标本的泛胶质瘤和多癌分析
一、分层和b条，627例泛胶质瘤样本中11例F3-T3阳性（红色）的共识聚类。11个F3-T3阳性样品（红色）b条落在一起（蓝色）。c（c），具有统计意义的GO类别的丰富地图网络(问-值<0.001，NES>0.6，双侧Mann-Whitney-Whilcoxon试验）。节点表示GO术语，线条表示其连通性。节点的大小与GO类别中的基因数量成正比，线条的厚度表示组之间共享的基因的比例。d日，泛胶质瘤队列中F3-T3阳性样本中“Hallmark氧化磷酸化”GO类别的Mann-Whitney-Whilcoxon富集图。e（电子），86个LUSC样本中4个F3-T3阳性（红色）的分层聚类。（f）、具有统计意义的GO类别的丰富地图网络(问-值<0.001，NES>0.6，双侧Mann-Whitney-Whilcoxon试验）。克，36个样本中2个F3-T3阳性、HPV阳性HNSC（红色）的分层聚类。小时、具有统计意义的GO类别的丰富地图网络(问-值<0.001，NES>0.6，双侧Mann-Whitney-Whilcoxon试验）。我，对184个ESCA样本中的2个F3-T3阳性（红色）样本进行分层聚类。2个F3-T3阳性样品的热图放大到左侧。j个，对305个CESC样本中的4个F3-T3阳性（红色）样本进行分层聚类。k个，对408份BLCA样本中的5份F3-T3阳性（红色）样本进行分层聚类。我，使用方差归一化欧几里得距离和局部线性嵌入作为滤波函数重建的泛神经胶质瘤样本（n=627）的TDA网络。包含F3-T3阳性样本的节点以红色突出显示。米，多肿瘤队列中三个排名靠前的线粒体功能类别的F3-T3（总片段的Log2，x轴）和NES（y轴）的表达之间的相关性，包括来自8种肿瘤类型的F3-T_3阳性样本（n=19）(第页和P（P）-显示值，双侧Mann-Whitney-Whilcoxon试验）。n个，全胶质瘤队列中MRs活性分析（n=627胶质瘤）。灰色曲线表示每个MR的活性，肿瘤样本根据MR活性排序。红线和蓝线分别表示单个GBM样品显示高和低MR活性。P（P）-显示了F3-T3阳性和F3-T3-阴性样品中差异活性（左栏）和MR（右栏）活性平均值的双侧Mann-Whitney-Whilcoxon试验值。o个，的基因表达分析PPARGC1A公司和ESRRG公司F3-T3阳性和F3-T3-阴性GBM基因；n=9例F3-T3阳性肿瘤；n=525 F3-T3-阴性肿瘤。方框图跨越第一个四分位到第三个四分位数，晶须显示1.5×四分位范围。P（P）-值，双侧Mann-Whitney-Whilcoxon试验。中的数据一,e（电子）,g、 我-k个使用欧几里德距离和Ward连锁方法获得，分别基于上调或下调概率最高和最低的前50个和后50个基因。
扩展数据图7
扩展数据图7。PGC1α和ESRRG是F3-T3转化细胞的线粒体代谢和肿瘤发生所必需的
一，沉默后HA-F3-T3内源性PGC1α的免疫印迹PIN码4并用WT或Y122F PIN4重新组装。将HA中PGC1α的外源性表达作为阳性对照。实验独立重复三次，结果相似。b条，qRT-PCR用于PPARGC1A公司HA-F3-T3或HA-vector中。数据为两个独立实验的平均值±标准差（n=6次重复），每个实验均进行三次。c（c），qRT-PCRPPARGC1A公司在HA-F3-T3中，按一数据为四个独立实验的平均值±标准差（n=4个生物复制品）。d日，基因集富集分析（GSEA）显示，与HA载体（n=3个生物重复）相比，HA-F3-T3（n=5个生物重复）中ROS解毒基因上调。标称P（P）-指示值。e（电子），在HA-F3-T3沉默后对FLAG-PIN4（WT和Y122F）和PGC1α（WT与L2L3A）进行免疫印迹PIN码4。实验独立重复两次，结果相似。（f）、沉默后HA-F3-T3的软琼脂集落形成试验PIN码4在存在或不存在PGC1α的情况下，用WT或Y122F FLAG-PIN4进行重组。数据为两个独立实验中一个代表性实验的平均值±标准差（n=3个技术复制品）。克，qRT-PCR用于PPARGC1A型用sh转导的HA-vector或HA-F3-T3PPARGC1A公司-1或shPPARGC1A公司-2慢病毒。数据为一个代表性实验的平均值±标准差（n=3个技术重复）。小时，HA-F3-T3中PGC1α的免疫印迹分析克。实验独立重复两次，结果相似。PGC1α的外源性表达作为阳性对照。实验独立重复两次，结果相似。我，qRT-PCR用于PPARGC1A公司在HA-F3-T3中表达两个独立的gRNAPPARGC1A公司（g核糖核酸-PPARGC1A-1，2个克隆，gRNA-PPARGC1A-2，1克隆）或空向量。数据为一个代表性实验的平均值±标准差（n=3个技术重复）。j个，细胞的Western blot我使用指示的抗体。实验独立重复两次，结果相似。k个HA-vector或HA-F3-T3的OCR转导PPARGC1A公司克核糖核酸-1或g核糖核酸-2.数据为两个独立实验中一个代表性实验的平均值±标准差（n=5个技术复制品）。P（P）：<0.001，对于比率1-4和9-12，双尾t检验，不相等方差。我，qRT-PCR用于欧洲可再生能源公司感染sh的HA-vector或HA-F3-T3ESRRG公司-1或shESRRG公司-2慢病毒。数据为一个代表性实验的平均值±标准差（n=3个技术重复）。米，HA-F3-T3中ESRRG的免疫印迹分析我独立地重复实验两次，结果相似。n个，HA的软琼脂集落形成试验，如图3g所示。数据为一式三份的两个独立实验中一个代表性实验的平均值±标准差（n=3个技术副本）。o个，GSC1123细胞被转导PPARGC1A公司慢病毒或空载体。细胞分析方法在体外本地设计院。代表性回归图用于计算三种独立感染的96周培养物中胶质瘤球的频率。第页，条形图显示了LDA分析的三种独立感染的胶质瘤球的频率，如o个数据为平均值±s。d日（n=3个生物重复）。问，照片显示由sh转导的HA-F3-T3产生的肿瘤PPARGC1A公司-1，什欧洲可再生能源公司-1或图3i中小鼠安乐死时的载体慢病毒。sh-P、shPPARGC1A公司-1; sh-E、shESRRG公司-1.第页，qRT-PCR用于第1a部分单位：mGSC-F3-T3-shTP53型和mGSC-HRAS-12V-shTP53型用sh转导第1a部分-1或shP参数1a-2慢病毒。数据为一个代表性实验的平均值±标准差（n=3个技术重复）。秒，mGSC-F3T3-sh肿瘤体积TP53型表达pLKO载体（n=5），sh第1a部分-1（n=5）或sh第1a部分-2（n＝5）。数据是单个小鼠的肿瘤生长曲线。t吨、皮下注射mGSC-HRAS-12V-sh小鼠肿瘤体积TP53型表达pLKO载体（n=5）或sh第1a部分-1（n=5）或sh第1a部分-2（n=5）。数据为单个小鼠的肿瘤生长曲线；P（P）：ns，双尾t检验，不等方差（时间点1-7）。u个，图片显示mGSC-F3-T3-sh生成的肿瘤TP53型用sh转导第1a部分-1或sh第1a部分-2或载体慢病毒秒在老鼠安乐死的时候。v（v），图片显示mGSC-HRAS-12V-sh生成的肿瘤TP53型用sh转导第1a部分-1或sh第1a部分-2或载体慢病毒t吨在老鼠安乐死的时候。分子量显示，β-肌动蛋白或α-微管蛋白显示为所有免疫印迹中的负荷控制。P（P）：*<0.05，**<0.01，***<0.001，双尾t检验，不等方差。
扩展数据图8
扩展数据图8。果蝇PGC1α同系物斯巴格尔(斯里兰卡)介导F3-T3诱导的肿瘤生长
一，全脑-中央神经索复合体的光学投影果蝇属幼虫。F3-T3融合癌基因的表达回购Gal4(回购Gal4>由于胶质细胞过度增殖和积聚，F3-T3）泛胶质驱动因子导致大脑和腹神经索发生病理变化，并伴有异位组织突起（黄色箭头）。b条，携带F3-T3驱动的胶质瘤的幼虫存活。携带F3-T3驱动的神经胶质瘤的幼虫在发育成成年之前死亡（n=100个生物独立样本）。数据显示为平均值±标准误差。P（P）：*<0.05，双尾t检验，不等方差。单个圆点代表幸存动物的分数。c（c）与对照组相比，F3-T3的胶质表达导致胶质细胞总数（Repo+；mRFP+细胞）增加。注意脑叶（白色箭头）和腹神经索（黄色箭头）中的胶质细胞过度堆积。d日与对照组相比，F3-T3的胶质表达增加了胶质细胞增殖（mRFP+；pHH3+细胞）。注意脑叶（白色箭头）和腹神经索（黄色箭头）中的胶质细胞过度积聚。e（电子），胶质特异性斯里兰卡与对照组相比，F3-T3诱导的胶质瘤基因敲除导致胶质细胞总数（Repo+；eGFP+细胞）减少。（f）、对照组和对照组胶质细胞数量的量化斯里兰卡-肿瘤缺陷；（n=15用于回购Gal4>F3-T3；n=15用于回购Gal4>F3-TACC3；RNAiKK100201; n=16用于回购Gal4>F3-T3层；RNAiGL01019; n=11，用于回购Gal4>F3-T3层；RNAiHMS00857号; n=6用于回购Gal4>F3-T3层；RNAiHMS00858号数据显示为平均值±标准误差。P（P）：***<0.001，双尾t检验，不等方差。克Western blot分析repo-Gal4>F3-T3和repo-Gal 4>F3-T3中的F3-T_3蛋白；RNA干扰-srl果蝇大脑。F3-T3在人GSC1123中的表达显示为F3-T3的阳性对照，α-微管蛋白显示为负荷对照。中的实验c（c）——e（电子）,克执行了两次。
扩展数据图9
扩展数据图9。胶质特异性击倒斯里兰卡对EGFR-PI3K诱导的肿瘤生长几乎没有影响，但对胶质细胞特异性敲除有影响错误抑制F3-T3诱导的肿瘤生长
一，对照组和斯里兰卡-胶质细胞缺乏。b条，胶质特异性斯里兰卡幼虫大脑中的敲除对整个胶质细胞种群（Repo+细胞）和胶质细胞有丝分裂指数（Repo+pHH3+细胞，黄色箭头）没有显著影响。c（c），用对照和斯里兰卡-胶质细胞缺陷；n=13repo-Gal4>eGFP; n=14用于repo-Gal4>eGFP；RNAiKK100201；n=16，对于repo-Gal4>eGFP；RNAiHMS00857。数据为平均值±标准差。P（P）：ns，双尾t检验，不等方差。d日，幼虫脑中增殖胶质细胞数量（Repo+；pHH3+细胞）的量化斯里兰卡-胶质细胞缺陷；n=13repo-Gal4>eGFP; n=14用于repo-Gal4>eGFP；RNAiKK100201；并且n＝16用于repo-Gal4>eGFP；RNAiHMS00857。数据为平均值±标准差。P（P）：ns，双尾t检验，不等方差。e（电子），repo-Gal4>F3-T3和repo-Gal 4>F3-T3的成人致死率；RNA干扰-斯里兰卡幼虫（n=100）。（f）、控制和斯里兰卡-脑肿瘤缺陷repo-Gal4>Dp110民航总局；dEGFR公司λ；mRFP公司幼虫。克、对照组肿瘤体积的量化斯里兰卡-肿瘤缺陷；n=15用于repo-Gal4>Dp110民航总局；dEGFR公司λ；mRFP公司; n=16用于报告-Gal4>Dp110民航总局；dEGFR公司λ；mRFP；RNAiKK100201; n=19repo-Gal4>Dp110民航总局；dEGFR公司λ；mRFP；RNAiHMS00857号数据为平均值±标准差。P（P）：ns，双尾t检验，不等方差。小时，脑肿瘤的光学投影果蝇属幼虫回购Gal4>F3-T3和回购Gal4>F3-T3；RNAi-ERR（RNAi-ERR）RNAi介导的敲除错误减少F3-T3诱导的胶质瘤体积。我、对照组肿瘤体积的量化错误-肿瘤缺陷；n=20回购Gal4>F3-T3；n=16用于回购Gal4>F3-T3层；RNAiJF02431号; n=19，用于回购Gal4>F3-T3层；RNAiHMC03087; n=19，用于回购Gal4>F3-T3层；RNAiKK10839).P（P）：***<0.001，双尾t检验，不等方差。在所有实验中，n都是生物学上独立的动物。中的实验一,b条,（f）,小时重复两次，结果相似。
扩展数据图10
扩展数据图10。F3-T3融合的急性表达通过PIN4的Y122磷酸化诱导过氧化物酶体的生成
一，表达F3-T3的载体和HA中总PIN4（PIN4，红色，左侧面板）和pY122-PIN4（pPIN4、红色，中间面板）的免疫荧光染色的代表性共焦显微照片（最大强度）。右侧面板显示较高放大倍数的虚线框。细胞核用DAPI（蓝色）复染。实验独立重复两次，结果相似。b条，HA-F3-T3中FGFR3（绿色，中间面板）和pY122-PIN4（红色，右侧面板）双重免疫荧光染色的共焦图像最大强度。箭头表示蛋白质共同定位。实验独立重复两次，结果相似。c（c），使用PIN4抗体从H1299细胞共免疫沉淀。使用所示抗体通过western blot分析内源性PIN4免疫复合物和输入（WCL）。PEX1、PEX6、SUN2和NUP214的输入为10%；SEC16A和DHX30为5%；PIN4为2%。d日，HA-F3-T3中外源性FLAG-PEX1共同免疫沉淀的Western blot分析。WCL：PIN4为1%，PEX1和PEX6为10%。实验独立重复四次，结果相似。e（电子），qRT-PCR用于聚乙烯X1HA-F3-T3和HA-vector中。数据为三次独立实验中一次代表性实验的平均值±标准差（n=3个技术副本）。（f），用F3-T3、F3-T3-K508M或空载体转导的HA中PEX1表达的蛋白质印迹分析。β-actin显示为负荷控制。实验独立重复三次，结果相似。克，western blot分析HA中F3-T3表达的时间进程。α-微管蛋白显示为负荷控制。实验独立重复两次，结果相似。小时，通过高含量荧光显微镜测量内源性沉默后用PIN4-WT或PIN4-Y122F重组HA中OPP掺入对蛋白质生物合成的定量PIN码4并与F3-T3或载体剧烈转导。三分之一独立实验的代表性条形图（n=4个技术复制品）。电话：*<0.05，***<0.001，双尾t检验，不等方差。使用经环己酰亚胺（CHX）处理的培养物作为阴性对照。我用qRT-PCR对HA中表达F3-T3或空载体的指示线粒体基因进行时间进程表达分析。数据为一式三份的两个独立实验中一个代表性实验的平均值±标准差（n=3个技术副本）。将值归一化为矢量（虚线）。电话：*<0.05，**<0.01，***<0.001，双尾t检验，不等方差）。j个，用PIN4-WT或PIN4-Y122F重组的HA中内源性ROS沉默后细胞ROS的定量（通过高含量显微镜测量）PIN码4并与F3-T3或载体剧烈转导。三分之一独立实验的代表性条形图。数据为平均值±标准差（n=3个技术复制品）。电话：*<0.05，（双尾t检验，不等方差）。NAC处理的培养物用作阴性对照。所有免疫印迹中都显示了分子量。
图1
图1。F3-T3激活线粒体生物生成和代谢
一HA-F3-T3、HA-F3-T_3-PD173074之间DEG的层次聚类（每组5个生物独立样本）。HA-vector和HA-F3-T3-K508M（每组3个生物独立样本）作为对照。P（P）-值，双侧Mann-Whitney-Whilcoxon试验。b条、具有统计意义的GO类别的丰富地图网络(问-F3-T3中的值10E-6相对于F3-T3-PD173074、F3-T3-K508M或矢量）。节点表示GO术语及其连接线。节点大小与类别中的基因数量成正比，线条厚度表示组间共享的基因比例。c（c）、线粒体DNA（mtDNA）在HA-F3-T3、F3-T3-K508M或载体中的qPCR。d日，HA中细胞ATP的定量c（c）.e（电子）HA-F3-T3的OCR，带或不带AZD4547。（f）GSC1123和GSC308在使用指定的线粒体抑制剂治疗后的存活率。克，mGSC-F3-T3-sh的存活率TP53型和mGSC-HRAS-12V-shTP53型用赋形剂或替加环素治疗。小时，用载体（n=8）或替加环素（n=10）治疗的小鼠肿瘤体积。数据为对照组的折叠变化±s.e.m。显示了每个时间点研究中剩余的小鼠数量。数据代表两种情况(（f）,克)或三个(e（电子）)独立实验。数据为折叠变化±标准差(c（c）)或平均值±标准差(d日-克)n=3个技术复制品(e（电子）-克);c（c）,d日n=6和n=12分别来自两个独立实验*P（P）≤0.05, **P（P）≤0.01, ***P（P）≤0.001，双尾t吨-检验，不等方差。
图2
图2。Y122处PIN4磷酸化影响线粒体代谢
一，SF126胶质瘤细胞磷酸酪氨酸免疫沉淀物的免疫印迹（左面板）。右侧面板，全细胞裂解物（WCL）。Paxillin正在加载控制。b条F3-T3阳性和F3-T3-阴性GBM的pY122-PIN4积分平均荧光强度（IMFI）的量化。方框图跨越第一个四分位数到第三个四分位，晶须显示1.5×四分位数范围。P（P）≤0.0001，双面Mann-Whitney试验。c（c），用PIN4 WT、PIN4-Y122F或载体转导的HA-F3-T3的OCR。d日、HA-F3-T3的OCR，在消声后PIN码4并用PIN4-WT或PIN4-Y122F重新组装。e（电子），HA的软琼脂集落形成试验d日中的数据c-e公司是一个具有代表性的实验的平均值±标准差，其中n=3个技术重复。实验重复了三次，结果相似**P（P）≤0.01, ***P（P）≤0.001，双尾t吨-检验，不等方差。
图3
图3。F3-T3介导的线粒体代谢和肿瘤发生需要PGC1α和ESRRG
使用9个F3-T3阳性样本（红色）中的DEG对ATLAS-TCGA中的GBM（n=534）和正常大脑（n=10）进行分层聚类。b条，9个F3-T3阳性样本中具有统计学意义的GO类别的富集图网络（双侧Mann-Whitney-Whilcoxon检验问-值<0.001，NES>0.6）。c（c），量化F3-T3阳性和F3-T3-阴性GBM中VDAC1、NDUFS4和COXIV的IMFI。方框图跨越第一个四分位数到第三个四分位，晶须显示1.5×四分位数范围。P（P）≤0.0001（VDAC和NDUFS4）；P（P）≤0.05（COXIV），双面Mann-Whitney试验。d日，GBM中的MR活性。灰色曲线表示每个MR的活性。红色和蓝色线条分别表示单个GBM（n=534）显示高或低MR活性。P（P）-值，双边Mann-Whitney检验。e（电子）人（h）和小鼠（m）GSC中PGC1α的免疫印迹。用PGC1α或载体转导的HA为对照。（f）、HA-F3-T3的OCR，在消声后PIN码4在存在或不存在PGC1α-WT或PGC1α-L2L3A的情况下，用PIN4-WT或PIN4-Y122F重组。克，用sh转导的HA-F3-T3的OCRPPARGC1A公司.小时，用sh转导的HA-F3-T3的OCR欧洲可再生能源公司.我，用载体（n=4）转导的HA-F3-T3的肿瘤生长，shPPARGC1A-1（n=5）或shESRRG-1系统（n=5）。显示了单个小鼠的肿瘤生长曲线。j个，全脑中央神经索复合体光学投影的代表性图像果蝇属幼虫repo-Gal4>F3-T3和repo-Gal 4>F3-T3；RNA干扰-斯里兰卡.k个，量化果蝇属幼虫repo-Gal4>F3-T3和repo-Gal 4>F3-T3；RNA干扰-斯里兰卡肿瘤体积。数据（平均值±标准差）来自两个(（f），分别为n=3和n=5个技术复制品）或一个(克,小时，n=4个技术复制品；k个，数据为平均值±s.e.m.，n=6–17只幼虫）实验。实验重复了两到三次，结果相似**P（P）≤0.01, ***P（P）≤0.001（双尾）t吨-检验，不等方差(（f）-k个).
图4
图4。F3-T3融合蛋白的表达通过PIN4的Y122磷酸化诱导过氧化物酶体的生成
一，HA-vector和HA-F3-T3中PEX1免疫染色（红色）和DAPI（蓝色）的典型共焦显微照片。b条，染色样本中PEX1-IMFI的定量一（载体和F3-T3分别为34和26个细胞）。c（c），HA-vector和HA-F3-T3中pY122-PIN4（pPIN4，红色）和PMP70（绿色）的双（上面板）和单（下面板）免疫染色的代表性共焦显微照片。d日F3-T3在HA中表达后4天和8天每个细胞的过氧化物酶体数量的量化（n=13个细胞）。e（电子），HA-vector（左面板）中总PIN4和PMP70或HA-F3-T3（中面板）中pY122-PIN4和PMP 70双重免疫染色的代表性共焦显微照片。箭头，pY122-PIN4-PMP70共同定位（下面板）。右面板，pY122-PIN4-PMP70共同定位（上面板），具有相应的光谱强度剖面（中面板）和共同定位系数（下面板）。（f），HA-F3-T3沉默后每个细胞过氧化物酶体数量的量化PIN码4PIN4-WT或PIN4-Y122F的表达（n=19个细胞）。克，通过OPP掺入HA定量蛋白质生物合成d日经环己酰亚胺（CHX）处理的培养物为阴性对照；（n=5个技术复制品）。小时，qRT-PCR用于PPARGC1A公司HA中，按d日（n=3个技术复制品）。我、HA-vector、HA-F3-T3和F3-T3-K508M中细胞活性氧的定量。一个代表性实验的条形图（n=4个技术复制品）。j个，HA中细胞活性氧的分析d日一个代表性实验的条形图（n=5或6个技术复制品）。k个，qRT-PCR用于PPARGC1A公司用载体或NAC处理的HA-vector或HA-F3-T3（n=3个技术复制品）。中的结果g-k公司均为平均值±标准差。P（P）-值：b条,d日,（f），双侧Mann-Whitney-Whilcoxon试验；克-k个，双尾t吨-测试不等方差。方框图跨越第一个四分位到第三个四分位数，胡须表示最小和最大值。面板中的实验我重复两次；所有其他实验重复三次，结果相似。
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