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.2018年1月11日；8(1):556.
doi:10.1038/s41598-017-18774-0。

趋化因子受体CX3CR1介导缺血诱导的神经细胞死亡

王金坤 1, 颜甘 1 2, 韩鹏程 2, 尹俊祥 2, 刘庆伟 三, Soha Ghanian公司 2 4, 冯高 1, 广汇功 1, 汤志伟 5 6
附属公司

趋化因子受体CX3CR1介导缺血诱导的神经细胞死亡

王金坤等。 科学代表. .

摘要

趋化因子fractalkine（CX3CL1）及其受体CX3CR1在中风的病理生理学中起着基础性作用。先前的研究集中于产生分形碱的神经元与表达中枢神经系统CX3CR1受体的小胶质细胞之间的旁分泌相互作用。最近的研究表明，海马神经元具有CX3CR1受体的功能性表达，表明它们参与了神经保护和神经退行性作用。为了阐明神经元CX3CR1在缺血性卒中诱导的神经退行性变中的作用，采用小鼠永久性大脑中动脉闭塞（pMCAO）模型。在pMCAO小鼠中，阻断24小时后，纹状体和海马中观察到CX3CR1水平升高、凋亡相关的形态学变化和Caspase 3阳性神经元细胞。缺血神经元中CX3CR1的上调与神经元凋亡细胞死亡相关。相反，在CX3CR1缺陷小鼠中，缺血诱导的神经元细胞凋亡减少。与野生型小鼠相比，从CX3CR1缺陷小鼠培养的初级海马神经元通过阻断钙内流对谷氨酸诱导的兴奋毒性具有更强的抵抗力。我们首次报道了神经元CXCR1在缺血时介导神经元凋亡细胞死亡。我们的结果表明，调节CXCR1活性为中风提供了一种新的治疗策略。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
出生后小胶质细胞缺失的神经元培养物表达CX3CR1，并在OGD下过度表达CX3CR1。(A）从出生后C57BL/6小鼠制备的成熟海马培养物，并用2.5 μM阿糖胞苷（AraC）用抗CX3CR1（红色）和抗MAP2（绿色）染色。CX3CR1与MAP2显著共同本地化+正常海马培养的细胞体（中面板）。与正常培养条件相比，OGD处理的神经元过表达CX3CR1（上图）。未经CX3CR1染色的正常培养物作为实验对照（下面板）。比例尺 = 100 微米 = 4/组。(B类)通过使用VisionWorks计算平均密度来评估CX3CR1的表达®LS图像采集和分析软件（UVP，LLC，CA，USA）。
图2
图2
pMCAO小鼠梗死脑神经元中CX3CR1上调。(A类)C57BL/6小鼠同侧半球（底部面板）的近场区（1）、海马（2）和纹状体（3）、对侧半球（中部面板）的对应区域和完整的对照半球（上部面板）中有代表性的CX3CR1染色24 pMCAO后小时。(B类)CX3CR1和NeuN双重染色显示，CX3CR1主要表达于梗死区缺血神经元。(C类)半定量分析显示CX3CR1/NeuN阳性细胞数显著增加24个 pMCAO后小时（**p < 0.01). 在三个单独的实验中，每组四只复制小鼠的五个切片上，在5个随机选择的200倍放大场中对细胞进行计数。(天)脑缺血中CX3CR1蛋白的表达。使用从同侧、对侧和完整对照半球获得的脑匀浆进行蛋白质印迹分析24 pMCAO后小时。结果被量化并归一化为β-肌动蛋白。比例尺 = 100 微米 = 4/组。
图3
图3
CX3CR1与pMCAO小鼠神经元凋亡死亡的偶联。(A类)用裂解的Caspase-3（凋亡标记物）、CX3CR1和NeuN（神经元标记物）进行三重染色，证明CX3CR1在缺血性损伤24中与凋亡神经元偶联 pMCAO后小时。比例尺 = 100 微米 = 4/组。(B类)半定量分析表明，同侧半球Caspase-3/CX3CR1/NeuN阳性细胞的数量显著增加（**p < 0.01 vs.对侧和完整对照），而对侧和对照半球之间的这些部位没有观察到差异。在三个单独的实验中，每组四只复制小鼠的五个切片上，在5个随机选择的200倍放大场中对细胞进行计数。
图4
图4
CX3CR1缺乏可减轻pMCAO后的梗死体积和神经功能缺损。(A类)脑血流量（CBF）分析显示，右大脑中动脉区域的血流量在闭塞后显著下降（正常168.3 ± 8.5 毫升/100 克/分钟vs.pMCAO 37.3 ± 10.3 毫升/100 g/min）。CX3CR1之间没有差异+/+和CX3CR1−/−组。(B类)表观扩散系数（ADC）和T2加权MRI成像分别显示30岁时的受损体积 min和梗死体积24 CX3CR1之间pMCAO后小时+/+和CX3CR1−/−组。(C类)TTC染色显示梗死体积与T2图像相同。(天)定量分析显示两组之间受损体积相似30 pMCAO后min，而梗死体积为24 CX3CR1患者pMCAO后小时数明显减少−/−小鼠（*p < 0.05与CX3CR1+/+). (E类)在具有类似ADC的受损大脑中，CX3CR1的96.7%+/+与CX3CR1的71.9%相比−/−该组于24日开始缺血 小时，如T2加权MRI所示(F类)CX3CR1缺乏缓解了小鼠的神经系统缺陷24 缺血后小时（*p < 0.05). 显示了具有代表性的图像；n个 = 每组9-13人。
图5
图5
缺乏CX3CR1可降低pMCAO后Caspase-3阳性神经元细胞的数量。(A类)同侧（1）近区、（2）海马和（3）纹状体Caspase-3抗体的免疫组织化学染色24 pMCAO后小时。(B类)Caspase-3阳性细胞数量的半定量分析表明，CX3CR1缺陷降低了近梗死区、海马和纹状体的凋亡细胞数量（*p < 0.05，**p < 0.01与CX3CR1之比较+/+组）。(C类)Caspase-3和NeuN双重染色显示CX3CR1−/−小鼠梗死区凋亡神经元少于CX3CR1+/+pMCAO后的小鼠。(天)Caspase-3/NeuN阳性细胞的半定量分析表明，CX3CR1缺乏降低了梗死区凋亡神经元的数量（**p < 0.01与CX3CR1之比较+/+组）。显示了具有代表性的图像；比例尺 = 50 微米，n = 4/组。在三个独立的实验中，从小鼠的五个切片上随机选择5个200倍放大视野，对细胞进行计数。
图6
图6
CX3CR1缺乏对谷氨酸诱导的神经元凋亡的保护作用在体外. (A类)谷氨酸暴露30天后神经元的形态学变化 最小值（1和2）培养的健康CX3CR1+/+和CX3CR1−/−神经元延伸出几个树突干，树突有许多突起。（3） 谷氨酸处理导致CX3CR1树突破裂和胞体收缩+/+神经元，而（4）CX3CR1缺陷保护神经元免受这种损伤，导致诱导形成珠状结构，仅减少细小突起。（5） 用抗CX3CR1抗体中和CX3CR1可以减轻谷氨酸的损伤，（6）而同一动物源的抗IgG抗体不能减轻这种损伤。(B类)通过测量各组神经元释放的LDH来评估细胞死亡。谷氨酸处理可以增加LDH的释放，而CX3CR1缺乏可以减弱LDH的增加。此外，中和CX3CR1也可以减弱LDH的增加。(C类)采用MTT法评估谷氨酸治疗后神经元存活率。CX3CR1缺乏和中和可以减少谷氨酸诱导的神经元死亡（*p < 0.05，**p < 0.01). 显示了具有代表性的图像；比例尺 = 50 微米 = 10/组。
图7
图7
CX3CR1缺乏减少谷氨酸处理神经元的钙内流。(A类)显示了钙内流的典型痕迹。谷氨酸处理后很快发生内流，并迅速达到峰值，而CX3CR1缺乏和中和显著降低内流。(B类)钙内流的体积是通过钙增加的倍数来计算的。CX3CR1中的钙增加了大约六倍+/+神经元，但在CX3CR1中只有大约两倍−/−组。中和CX3CR1可以减弱钙的增加。(C类)记录达到峰值钙浓度一半的时间，这表示钙内流速度。CX3CR1缺乏和中和显著降低了钙内流速率（**p < 0.01）。n个 = 20–30/组。
图8
图8
小鼠缺血性中风中神经元CX3CR1的神经退行性机制图。神经元CX3CR1通过激活半胱氨酸蛋白酶和谷氨酸诱导的钙内流介导缺血性卒中中的神经元凋亡。因此，CX3CR1缺陷改善了缺血性中风模型小鼠的预后。
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