DEPDC5 deficiency contributes to resistance to leucine starvation via p62 accumulation in hepatocellular carcinoma

doi:10.1038/s41598-017-18323-9

.2018年1月8日；8(1):106.

doi:10.1038/s41598-017-18323-9。

DEPDC5缺乏通过p62在肝细胞癌中的蓄积促进对亮氨酸饥饿的抵抗

附属公司

¹日本东京医学和牙科大学医学研究生院分子肿瘤学系。
²日本东京医科和牙科大学医学研究生院肝胆胰外科。
^三日本东京医学和牙科大学医学研究所分子神经科学实验室。
⁴日本东京医学和牙科大学医学研究生院分子病毒学系。
⁵日本东京医学和牙科大学医学研究生院分子肿瘤学系。tanaka.monc@tmd.ac.jp。
⁶日本东京医科和牙科大学医学研究生院肝胆胰外科。tanaka.monc@tmd.ac.jp。

PMID： 29311600
预防性维修识别码： PMC5758822
内政部： 10.1038/s41598-017-18323-9

DEPDC5缺乏通过p62在肝细胞癌中的积累对亮氨酸饥饿的抵抗作用

水野由纪等。科学代表. 2018.

.2018年1月8日；8(1):106.

doi:10.1038/s41598-017-18323-9。

附属公司

¹日本东京医学和牙科大学医学研究生院分子肿瘤学系。
²日本东京医科和牙科大学医学研究生院肝胆胰外科。
^三日本东京医学和牙科大学医学研究所分子神经科学实验室。
⁴日本东京医学和牙科大学医学研究生院分子病毒学系。
⁵日本东京医学和牙科大学医学研究生院分子肿瘤学系。tanaka.monc@tmd.ac.jp。
⁶日本东京医科和牙科大学医学研究生院肝胆胰外科。tanaka.monc@tmd.ac.jp。

PMID： 29311600
预防性维修识别码： PMC5758822
内政部： 10.1038/s41598-017-18323-9

摘要

众所周知，分支链氨基酸（尤其是亮氨酸）血浓度的降低会促进慢性肝病患者的肝癌发生，但其机制尚不清楚。我们利用CRISPR/Cas9系统建立了敲除DEPDC5的肝细胞癌（HCC）细胞，并阐明了在亮氨酸饥饿条件下，DEPDC5-KO细胞的存活率高于DEPDC5-野生型（DEPDC5-VT）细胞。考虑到自噬缺陷可能与获得性抗亮氨酸剥夺有关，我们观察到LC3-II减少，随后DEPDC5-KO中p62积累，从而诱导活性氧（ROS）耐受。DEPDC5的过度表达抑制了免疫功能低下小鼠的细胞增殖和致瘤性，并通过增加ROS敏感性触发p62降解。在HCC患者的临床标本中，DEPDC5表达降低与p62过度表达呈正相关，且DEPDC5-阴性患者的无进展（PFS）和总生存期（OS）比DEPDC5-阳性患者更差。此外，多变量分析表明DEPDC5是PFS和OS的独立预后因素。因此，在慢性肝病的亮氨酸缺乏条件下，DEPDC5失活增强了HCC的ROS抵抗，导致患者预后不良。它可能是氧化应激控制癌症治疗的潜在靶点。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
利用CRISPR/Cas9系统建立DEPDC5-KO肝癌细胞。(一)DEPDC5蛋白结构示意图。灰色和黑色条显示了ICGC公共数据中由错义和停链突变引起的氨基酸替换的位置。箭头表示本研究中使用CRISPR/Cas9技术将sgRNA靶向敲除的位置。(b条)sgRNA靶点周围DEPDC5-KO JH5和HLE细胞的序列色谱图（灰色背景色）。(**c（c）**)用DEPDC5染色法（红色）对DEPDC5-WT和-KO JHH5及HLE细胞进行免疫荧光分析。细胞核用DAPI（蓝色）复染。放大倍数，×200。

图2
DEPDC5-KO细胞对亮氨酸剥夺的细胞反应涉及自噬途径。(一)DEPDC5-WT和-KO JHH5及HLE细胞的增殖曲线。每个样本的值与第1天的值相对。误差线为平均值 ± S.D.公司。*P（P）*数值由韦尔奇计算t吨-测试。(b条)PI染色流式细胞术分析。每个阶段的百分比为平均值 ± S.D.公司。*P（P）*数值由韦尔奇计算t吨-测试。(**c（c）**)LC3B和p62的免疫印迹。将细胞暴露于无亮氨酸培养基中指定的时间段。GAPDH被用作负荷控制。(d日)用LC3（绿色）和p62（红色）染色在亮氨酸缺失条件下对DEPDC5-WT和-KO JH5及HLE细胞进行免疫荧光分析。细胞核用DAPI（蓝色）复染。放大倍数，×200。

图3
DEPDC5-KO肝癌细胞中细胞活性氧水平的降低。(一)CellROX细胞的代表性直方图。H2O2浓度为100 右侧面板中为μM。每个平均相对荧光强度（RFI）的值为平均值 ± S.D.公司。*P（P）*数值由韦尔奇计算t吨-测试。(b条)过氧化氢处理后细胞活力的剂量-反应曲线。*P（P）*根据方差分析表计算值。

图4
DEPDC5过表达对癌细胞生长的抑制，细胞ROS水平升高。(一)用DEPDC5染色（红色）对多西环素（DOX）诱导的表达DEPDC5-的HuH7细胞进行免疫荧光分析。细胞核用DAPI（蓝色）复染。放大倍数，×200。(b条)菌落形成效率的量化。误差条是平均值 ± S.D.公司。*P（P）*数值由韦尔奇计算t吨-测试。(**c（c）**)p62的免疫印迹。将细胞暴露于含有强力霉素的培养基中指定的时间段。GAPDH被用作负荷控制。(d日)CellROX细胞的代表性直方图图像。每个平均RFI的值为平均值 ± S.D.公司。*P（P）*数值由韦尔奇计算t吨-测试。(**e（电子）**)体内强力霉素诱导表达DEPDC5的肝癌细胞的致瘤性。上下面板显示移植肿瘤的生长曲线和代表性的照片图像。误差线为平均值 ± 上面板中的S.E。*P（P）*数值由韦尔奇计算t吨-测试。白色比例尺为1 下面板中的cm。

图5
肝癌组织中DEPDC5和p62表达与患者预后的关系。(一)对包括邻近肝组织（N）和癌组织（T）在内的代表性组织样本中的DEPDC5和p62进行免疫组织化学分析。用苏木精对细胞核进行复染。在几乎所有病例的邻近肝组织中，DEPDC5呈阳性，p62呈阴性。(b条)根据DEPDC5和p62表达模式分类的HCC患者组无进展生存率和总生存率的Kaplan-Meier曲线。*P（P）*数值通过log-rank检验计算。

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1. 川口T、Izumi N、Charlton MR、Sata M.支链氨基酸作为慢性肝病的药理营养素。肝病学。2011;54:1063–1070. doi:10.1002/hep.24412。-内政部-公共医学
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[9] Stepien M等人。肝胆癌中氨基酸和生物胺代谢的改变：前瞻性队列研究的结果。国际癌症杂志。2016;138:348–360. doi:10.1002/ijc.29718。-内政部-公共医学

[10] Stepien M等人。肝胆癌中氨基酸和生物胺代谢的改变：前瞻性队列研究的结果。国际癌症杂志。2016;138:348–360. doi:10.1002/ijc.29718。-内政部-公共医学

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