Engineered cardiac tissue patch maintains structural and electrical properties after epicardial implantation

doi:10.1016/j.biomaterials.2018.01.002

.2018年3月：159:48-58。

doi:10.1016/j.biomaterials.2018.01.002。 Epub 2018年1月3日。

心外膜植入后，工程心脏组织补片保持结构和电气特性

克里斯托弗·杰克曼¹, 阿斯文·加纳帕蒂², Huda Asfour公司¹, 应倩¹, 布莱恩·艾伦¹, 李彦珍¹, 内纳德·布尔萨克^三

附属公司

¹美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学生物医学工程系。
²杜克大学医学中心，美国北卡罗来纳州达勒姆普外科。
^三美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学生物医学工程系电子地址：nbursac@duke.edu。

PMID： 29309993
预防性维修识别码： PMC5801076
内政部： 10.1016/j.生物材料.2018.01.002

心外膜植入后，工程心脏组织补片保持结构和电气特性

克里斯托弗·杰克曼等。生物材料. 2018年3月.

.2018年3月：159:48-58。

doi:10.1016/j.biomaterials.2018.01.002。 Epub 2018年1月3日。

作者

克里斯托弗·杰克曼¹, 阿斯文·加纳帕蒂², Huda Asfour公司¹, 应倩¹, 布莱恩·艾伦¹, 李彦珍¹, 内纳德·布尔萨克^三

附属公司

¹美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学生物医学工程系。
²杜克大学医学中心，美国北卡罗来纳州达勒姆普外科。
^三美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学生物医学工程系电子地址：nbursac@duke.edu。

PMID： 29309993
预防性维修识别码： PMC5801076
内政部： 10.1016/j.生物材料.2018.01.002

摘要

功能性心脏组织工程有望成为心肌梗死和心力衰竭的候选治疗方法。能够与宿主心肌进行机电耦合的“强压缩和快速传导”心脏组织补片的产生可以有效改善心脏功能，而不会增加致心律失常的风险。为此，我们设计了由新生大鼠心室细胞制成的高功能1 cm×1 cm心脏组织补片，在培养2周后，其收缩力为18.0±1.4 mN，传导速度（CV）为32.3±1.8 cm/s，当起搏频率高达8.7±0.8 Hz时，可维持慢性激活。用基因编码钙指示剂（GCaMP6）转导的贴片植入成年大鼠心室，4-6周后通过GCaMP6-报告钙的双相机光学成像评估动作电位传导和电整合²⁺贴片中的瞬态和受体心脏中RH237报告的动作电位。在13个植入的贴片中，11个（85%）植入，保持结构完整，传导动作电位平均CV和Ca²⁺暂时持续时间与植入前相当。尽管移植物的电特性保持不变，但在斑块和宿主心肌细胞之间不能诱导顺行或逆行传导，表明缺乏电整合。植入的贴片没有改变下层心肌的电特性。从免疫染色分析来看，植入的斑块具有高度的血管化，并表达丰富的机电连接，但仍由非心肌细胞层与心外膜隔开。总之，我们的研究表明，产生了功能强大的心脏组织补片，可以牢固地植入心外膜表面，形成血管，维持电功能，但不与宿主组织结合。因此，缺乏移植物-宿主电整合是发展用于心脏修复的有效组织工程疗法的关键障碍。

关键词：心脏组织工程；传导速度；电气耦合；收缩力；光学测绘。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有与本研究相关的利益冲突。

数字

**图1。工程化心脏组织补片的结构**
**（A）**PDMS模具和多孔尼龙框架，用于制作组织补片。**（B）**培养12天后，设计大鼠心脏补片，显示框架外部、框架内部和补片本身的尺寸。**（C）**对于等距力测试贴片，只有侧孔；黄色虚线表示组织和框架被切割的位置，允许沿白色箭头方向进行单向力测量。**（D）**培养两周后，对工程大鼠心脏补片进行肉毒杆菌α-肌动蛋白（SAA，红色）、波形蛋白（Vim，绿色）和DAPI（蓝色）染色，侧面投影来自共焦图像堆栈。**（E）**心脏补片的F-actin（F-act，红色）、胶原蛋白1（Col-1，绿色）和Vim（蓝色）染色。**（F–H）**SAA（红色）、DAPI（蓝色）和N-钙粘蛋白（Ncad，F）、连接蛋白43（Cx43，G）或CD31（H）绿色染色的工程大鼠心脏贴片。**（一）**Vim（红色）、CD31（绿色）和F-act（蓝色）的心脏补片染色。**（J）**GCaMP6慢病毒转导感染补丁中的大部分心肌细胞。SAA（红色）、GFP（绿色）和DAPI（蓝色）。

图2。工程化心脏组织补片的电气和机械功能*在体外*
**（A）**在左下角以4种不同起搏率（2、4、6和8 Hz）进行点刺激（脉冲信号）后，2周龄的工程心脏补片中动作电位传播的代表性等时图（顶行）和跨膜电压与时间的光学轨迹（底行）。**（B）**最大捕获率（MCR）是指每个刺激激发动作电位的最高速率。**（C）**动作电位传导速度（CV）与起搏周期长度（刺激脉冲之间的时间）。**（D）**80%复极时的动作电位持续时间（APD）vs.起搏周期长度。**（E）**不同组织伸长水平下工程心脏组织补片的等距主动力和被动力。n=（B–E）4个细胞隔离的6个斑块。

**图3。荧光记录显示大鼠心外膜植入后心脏组织补片的存活和功能**
**（A）**植入折叠成两半的工程心脏组织补片（左面板），然后拆除支架（右面板）。**（B–D）**GCaMP6植入后24-29天Langendorff灌注心脏的绿色荧光快照⁺用于健康心脏（B）、急性心肌梗死（C）或慢性心肌梗死（D）的工程心脏补片；左侧面板显示静止补丁，右侧面板显示钙峰值²⁺点刺激引起的短暂斑贴激活。**（E）**显示Ca的植入贴片比例²⁺对电刺激的瞬态响应。另请参阅：补充视频3。

**图4。宿主心脏和植入的工程心脏组织补片电信号的同步双光标测**
**（A）**带有标签组件的双摄像机光学成像系统照片：C类美洲，L（左）恩塞斯，D类平面镜，eX（X）引文过滤器，e米ission过滤器，以及H（H）心脏室。**（B）**光学标测系统示意图，描绘了贴片特异性钙指示剂（GCaMP6）和膜电压指示剂（RH237）的荧光激发以及通过二向色镜和发射滤光片分离它们的发射光谱。**（C）**电影快照显示心脏的自发活动（红色）和以1.5 Hz的频率进行电刺激的贴片（绿色）中的同步动作电位传播（脉冲信号指示电极位置）**（D）**电影快照显示了工程心脏贴片（绿色）的快速自发活动和以3.5 Hz的频率电刺激心脏（红色）的同时动作电位传播（脉冲信号指示电极位置）。**（E–F）**分别来自（C）和（D）的代表性单通道RH237（红色）和GCaMP6（绿色）信号；垂直虚线表示面板C（0–320 ms）和面板D（0–100 ms）中表示的时间段。另请参阅：补充视频4。

**图5。心脏和斑块中传播模式和传导速度的同步评估**
**（A）**贴片植入42天后，2 Hz点刺激（脉冲信号）后，工程心脏贴片（绿色）和心脏（红色）中的电波传播快照。**（B–C）**心脏（左）和斑块（右）的等时激活图(B类)以及来自心脏（RH237，红色）和补片（GCaMP6，绿色）的代表性光信号(C类)，源自面板中表示的传播影片A类.（D）在健康心脏（绿色）、急性心肌梗死（蓝色）或慢性心肌梗死（红色）的情况下，贴片CV与贴片植入持续时间的关系图。**（E–F）**指定贴片80%复极（CaD-80，F）时的平均CV（E）和钙瞬变持续时间*在体外*植入前的功能评估（pre，n=9）和植入后24–42天的移植者（post，n=10）。**（G–H）**植入贴片（Under）下方心脏区域的CV（G）和动作电位持续时间（APD，H）与距离贴片至少1 mm的区域（away）相比。另请参阅：补充视频5。

**图6。植入心脏组织补片的组织学评价**
**（A–B）**植入工程心脏补片后33天（A）或24天（B）心脏横切面的代表性苏木精和伊红染色。“P”和“H”分别表示斑块和心脏区域。**（C）**心脏横切面的代表性免疫荧光，植入贴片染色GFP（绿色）和肌球蛋白重链（MYH，红色，心肌细胞）。**（D）**植入贴片的高倍切片染色GFP（绿色）和肌动蛋白（SAA，红色）；插图显示了与DAPI（蓝色）合并的低倍图像。注意补片的横纹结构。**（E–F）**植入贴片染色GFP（顶行）和胶原蛋白1（Col-1，E类)或波形蛋白（Vim，F类)中间一排；底部一行显示了DAPI（蓝色）的合并图像。**（G）**植入贴片GFP染色的代表性切片（顶部），分支毛细血管血管性血友病因子染色（VWF，中部）；底部面板显示与DAPI合并的图像（蓝色）；插图显示了宿主心脏的GFP/VWF染色。**（H–I）**植入贴片的正面切片染色GFP、Ncad（H）或Cx43（I）和DAPI；插图显示宿主心脏的GFP/Ncad和GFP/Cx43染色。

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