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.2018年3月9日；293(10):3562-3587.
doi:10.1074/jbc。M116.772699。 Epub 2018年1月5日。

肿瘤应激源诱导细胞内P-糖蛋白介导的耐药的两种机制被溶酶体靶向的缩氨基硫脲所克服

Lina Al-Akra公司 1, 东亨贝尔 1, 苏米特·萨尼 1, 迈克尔·L·H·黄 1, Kyung Chan公园 1, Darius J R巷 1, 帕特里克·詹森 2, 德斯·理查森 三
附属公司

肿瘤应激源诱导细胞内P-糖蛋白介导的耐药的两种机制被溶酶体靶向的缩氨基硫脲所克服

Lina Al-Akra公司等。 生物化学杂志. .

摘要

多药耐药（MDR）是癌症治疗的主要障碍，因为肿瘤细胞能够通过药物转运蛋白外排化疗药物(例如P-糖蛋白（Pgp；ABCB1））。虽然Pgp介导的药物外排机制在质膜上已知，但细胞内Pgp的功能作用尚不清楚。此外，肿瘤微环境作为肿瘤治疗的靶点也受到了广泛关注。本研究旨在探讨肿瘤微环境应激对亚细胞Pgp表达、定位及其在MDR中的作用的影响(即营养缺乏、低血糖、活性氧和缺氧）诱导Pgp介导的耐药性。这是通过两种机制实现的，其中应激源诱导1）通过细胞内转运（1小时内）快速内化和重新分布Pgp，2）长时间孵育（4-24小时）后低氧诱导因子-1α表达，上调Pgp并伴随溶酶体生物发生。这两种机制增加了溶酶体Pgp，并促进了Pgp底物阿霉素的溶酶体积累，从而导致耐药性。这与溶酶体Pgp能够将底物运输到溶酶体一致。因此，肿瘤微环境应激源导致：1）Pgp重新分布到溶酶体；2） Pgp表达增加；3） 溶酶体生物发生；4）增强Pgp底物向溶酶体的转运。与阿霉素相反，当应激刺激增加细胞毒性Pgp底物二-2-吡啶酮4,4-二甲基-3-氨基硫脲（Dp44mT）的溶酶体积累时，这导致药物克服耐药性。总的来说，这项研究描述了一种克服应激性肿瘤微环境中耐药性的新方法。

关键词：ABCB1；P-糖蛋白；药物传递；耐药性；药物运输；溶酶体；肿瘤微环境；肿瘤微环境应激。

PubMed免责声明

利益冲突声明

D.R.R.是Oncochel Therapeutics LLC和Pty Ltd的股东，该公司正在开发用于治疗晚期和耐药癌症的缩氨基硫脲DpC

数字

图1。
图1。
A类和B类，DOX和Dp44mT的结构线图，以及它们与溶酶体中细胞内Pgp相互作用的不同作用机制。C类Western blots表明缺氧增加了“半耐药”KBV1细胞中Pgp的表达。A类(我)阿霉素的线条画；A类(ii（ii）)示意图显示，DOX通过Pgp流出细胞，但也可以通过这些细胞器中的Pgp转运到内体和溶酶体中（14）。DOX在溶酶体中的储存有助于对该药物产生耐药性，因为DOX在细胞核中与其分子靶点隔离(即溶酶体“安全屋”效应）（14）。B类(我),线条图Dp44mT的结构。B类(ii（ii）),示意图证明Pgp促进Dp44mT运输出细胞并进入内体/溶酶体（15–17，19）。然而，Dp44mT通过形成能有效生成ROS的铜络合物（15、17、18）克服了Pgp介导的耐药性。活性氧的产生导致LMP和凋亡，导致耐药癌细胞死亡，从而克服耐药性（15、17、18）。C类(我)在常氧条件下，KBV1（半耐药）细胞中的Pgp水平低于KBV1（全耐药细胞）(即21%O2).C类(ii（ii）)在37℃缺氧条件下培养24小时，KBV1（半耐药）细胞中的Pgp水平与KBV2（完全耐药细胞）中的Pgp水平相似(即1%O2). 蛋白质印迹C类(我)和C类(ii（ii）)是从三个典型的实验中得出的。密度测定为平均值±S.D(误差线) (n个= 3). ***,第页<0.001（相对于半抗细胞）。
图2。
图2。
微环境应激源、葡萄糖饥饿、血清饥饿和H2O（运行）2在常氧或缺氧条件下，KB31（Pgp极低）细胞或表达Pgp的KBV1细胞中Pgp和/或HIF-1α表达增加。KB31（极低Pgp）(A类,我)和KBV1（+Pgp）(A类,ii（ii）)细胞在葡萄糖饥饿（0μ米)、血清饥饿（无FCS）或H2O（运行）2应力（100μ米)常氧或缺氧(B类)在37°C下持续0、4、8和24小时。然后分离总蛋白，并通过蛋白质印迹分析评估Pgp和HIF-1α的表达。Western blot是三个独立实验的典型结果，密度分析代表平均值±S.D(误差线) (n个= 3). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页<0.001，相对于相应的0-h时间点。
图3。
图3。
微环境应激源、葡萄糖饥饿、血清饥饿和H2O（运行）2应激，增加正常氧和缺氧条件下内源性表达Pgp的肿瘤细胞中Pgp和HIF-1α的表达。DMS-53、DU-145、MDA-MB-231、PANC-1和PC3细胞在控制条件下（37°C下0或8小时）或在葡萄糖饥饿（0μ米)、血清饥饿（无FCS）或H2O（运行）2应力（100μ米)常压下(A类)或缺氧(B类)在37°C下持续8小时。然后分离总蛋白，并通过Western blotting分析评估Pgp和HIF-1α的表达。Western blot是三个独立实验的典型结果，密度分析代表平均值±S.D(误差线) (n个= 3). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页<0.001，相对于相应的0-h对照。
图4。
图4。
微环境应激源通过HIF-1α介导的途径上调Pgp。HIF-1α沉默使用siHIF-1型α相对于非目标控制siNC公司在KBV1（+Pgp）中，然后在控制条件下（0或8小时）或与微环境应激源、葡萄糖饥饿（0μ米)、血清饥饿（无FCS）和H2O（运行）2应力（100μ米)，在37°C下缺氧8小时。然后分离总蛋白，并通过Western blot分析评估Pgp和HIF-1α的表达。Western blot是三个独立实验的典型结果，密度分析代表平均值±S.D(误差线) (n个= 3). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页<0.001，相对于各自的0 h对照。#，第页< 0.05; ###,第页<0.001，相对于其各自siNC公司条件。
图5。
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在常氧和缺氧条件下，短期微环境应激增加了Pgp在溶酶体中的分布。KBV1（+Pgp）细胞在对照条件下（37℃下0和1小时）或在37℃下与微环境应激源孵育1小时，即葡萄糖饥饿（0μ米)，血清饥饿（无FCS），或H2O（运行）2应力（100μ米)常压下(A–C)或缺氧(D–F型).A类和D类Western blot分析正常氧或缺氧条件下与对照培养基或应激源孵育0或1小时后KBV1（+Pgp）细胞中Pgp和LAMP2的表达。印迹来自典型实验，密度测定代表平均值±S.D(误差线) (n个= 3).B类和E类共聚焦免疫荧光显微镜检测细胞，Pgp与特征良好的细胞器特异性抗体，即溶酶体抗LAMP2共同定位。细胞核用DAPI染色。这些图像是典型的三个独立实验，在C类和F类以任意单位表示(美国。)是平均值±S.D(n个= 3). *,第页< 0.05; ***,第页<0.001，相对于相应的0-h对照。比例尺，10微米；比例尺(放大的)，5微米；比例尺(特写镜头)，2.5微米。
图5。
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在常氧和缺氧条件下，短期微环境应激增加了Pgp在溶酶体中的分布。KBV1（+Pgp）细胞在对照条件下（37℃下0和1小时）或在37℃下与微环境应激源孵育1小时，即葡萄糖饥饿（0μ米)、血清饥饿（无FCS）或H2O（运行）2应力（100μ米)常压下(A–C)或缺氧(D–F型).A类和D类Western blot分析正常氧或缺氧条件下与对照培养基或应激源孵育0或1小时后KBV1（+Pgp）细胞中Pgp和LAMP2的表达。印迹来自典型实验，密度测定代表平均值±S.D(误差线) (n个= 3).B类和E类共聚焦免疫荧光显微镜检测细胞，Pgp与特征良好的细胞器特异性抗体，即溶酶体抗LAMP2共同定位。细胞核用DAPI染色。这些图像是典型的三个独立实验，在C类和F类以任意单位表示(美国。)是平均值±S.D(n个＝3）.*，第页< 0.05; ***,第页<0.001，相对于相应的0-h对照。比例尺，10微米；比例尺(放大的)，5微米；比例尺(特写镜头)，2.5微米。
图6。
图6。
在常氧和低氧条件下，长期低氧应激增加了Pgp的表达和Pgp在溶酶体中的分布。KBV1（+Pgp）细胞在常压下培养(A–C)或缺氧(D–E型)在37°C下持续0、4、8或24小时。然后用Western blotting检测细胞(A类和D类)共焦免疫荧光显微镜(B类和E类)Pgp与溶酶体抗LAMP2抗体共同定位。细胞核用DAPI染色。图像是三个独立实验的典型，在C类和F类以任意单位表示(美国。)是平均值±S.D(误差线) (n个= 3). **,第页< 0.01; ***,第页<0.001，相对于相应的0-h对照。比例尺，10微米；比例尺(放大的)，5微米；比例尺(特写镜头)，2.5微米。
图6。
图6。
在常氧和低氧条件下，长期低氧应激增加了Pgp的表达和Pgp在溶酶体中的分布。KBV1（+Pgp）细胞在常压下培养(A–C)或缺氧(D–E型)在37°C下持续0、4、8或24小时。然后用Western blotting检测细胞(A类和D类)共焦免疫荧光显微镜(B类和E类)Pgp与溶酶体抗LAMP2抗体共同定位。细胞核用DAPI染色。图像是三个独立实验的典型，在C类和F类以任意单位表示(美国。)是平均值±S.D(误差线) (n个＝3）.**，第页< 0.01; ***,第页<0.001，相对于相应的0-h对照。比例尺，10微米；比例尺(放大的)，5微米；比例尺(特写镜头)，2.5微米。
图7。
图7。
应激增加Pgp从质膜内化到组织蛋白酶D定义的溶酶体室。KBV1（+Pgp）细胞在常压下孵育，通过免疫荧光检测抗Pgp Ab和特征良好的溶酶体标记物组织蛋白酶D的共同定位，采用脉冲相分析评估Pgp的内化。A类，首先将平板在冰上冷却至4°C，然后添加抗Pgp抗体并在4°C的冰上孵育1 h，清洗、固定并渗透。在37°C控制或应力条件下的1小时内，清洗4°C平板，并添加含有应力源的预热培养基，并在37°C.下培养1小时。然后如上所述清洗、固定细胞。然后阻断细胞并用组织蛋白酶D抗体孵育。B类，4°C控制条件下的曲线图分析(我)，37°C控制(ii（ii）); 37°C（−）葡萄糖(三); 37°C（−）血清(iv（四）)和37°C（+）H2O（运行）2(v（v）).C类分析掩蔽组织蛋白酶D通道以使用ImageJ计算组织蛋白酶D-定义的溶酶体区域内外的Pgp。中的图像A类是三个独立实验的典型代表，第页<0.001，相对于各自的37°C控制。比例尺，10微米。密度测定为平均值±标准偏差(误差线) (n个= 3).
图8。
图8。
常压下的微环境应激源增加了Pgp依赖性DOX在表达Pgp的KBV1细胞溶酶体中的隔离，阻止DOX接近其核靶点。 A类KBV1（+Pgp）细胞在控制条件下（37℃下0或1小时）或37℃下在微环境应激源下孵育1小时，即葡萄糖饥饿（0μ米)、血清饥饿（无FCS）或H2O（运行）2应力（100μ米)在正常氧下。然后用DOX（25μ米)在存在或不存在Pgp抑制剂的情况下，Ela（0.2μ米)同样的压力源。用固有荧光DOX和针对溶酶体的LAMP2抗体或针对细胞核的DAPI抗体通过活细胞免疫荧光成像检查细胞。这些图像是典型的三个独立实验，在B类和C类以任意单位表示(美国。)为平均值±标准差(误差线) (n个= 3). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页<0.001，与相应的DOX控制相比B类和C类. #,第页< 0.05; ##,第页<0.01，与相对DOX治疗相比C.比例尺，10微米。
图9。
图9。
低氧下的微环境应激源增加了Pgp依赖性DOX在Pgp表达的KBV1细胞溶酶体中的隔离，阻止DOX接近其核靶点。 A类KBV1（+Pgp）细胞在控制条件下（0和1小时）或37°C下葡萄糖饥饿培养1小时（0μ米)、血清饥饿（无FCS）或H2O（运行）2应力（100μ米)在常压下。然后进行2小时/37°C的DOX培养（25μ米)在存在或不存在Pgp抑制剂的情况下，Ela（0.2μ米)同样的压力源。用固有荧光Pgp底物DOX和溶酶体抗LAMP2抗体通过活细胞免疫荧光成像检查细胞。细胞核（DOX的分子靶点）用DAPI染色。这些图像是典型的三个独立实验，在B类和C类以任意单位表示(美国。)是平均值±S.D(误差线) (n个= 3). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页<0.001，与相应的DOX控制相比B类和C类. #,第页< 0.05; ###,第页<0.001，与相对DOX治疗相比C.比例尺，10微米。
图10。
图10。
在常压下，微环境应激源仅在高Pgp表达细胞中增强Dp44mT介导的溶酶体损伤。 A类KB31（Pgp极低；i–xii)和KBV1（+Pgp；xiii–xxiv)细胞在常压下与对照培养基或应激源预孵育1小时，即葡萄糖饥饿、血清饥饿或h2O（运行）2应力（100μ米). 然后用Dp44mT（25μ米)在存在或不存在Pgp抑制剂的情况下，Ela（0.2μ米)，在37°C下持续24小时不存在或存在这些应激源（在常氧条件下）。溶酶体稳定性通过溶酶体嗜荧光团AO的活细胞免疫荧光成像进行检测，AO被隔离并保留在完整的溶酶体中。在高浓度吖啶橙溶酶体中，可以看到橙色荧光，而较低的细胞溶质和核浓度会产生绿色荧光。图像是三个独立实验的典型，在B类代表平均值±S.D(误差线) (n个= 3). ***,第页<0.001，相对于相应的KBV1控制††，第页相对于单独使用Dp44mT的相应治疗，第页< 0.01; ###,第页<0.001，相对于单独使用Dp44mT治疗KB31细胞。比例尺，10微米。
图11。
图11。
在缺氧条件下，微环境应激源增强了Dp44mT介导的低和高Pgp表达细胞的溶酶体损伤。 A类KB31（Pgp极低；i–xii)和KBV1（+Pgp；xiii–xxiv)缺氧条件下的细胞用对照培养基或应激源预培养1小时，即葡萄糖饥饿、血清饥饿或h2O（运行）2应力（100μ米). 然后用Dp44mT（25μ米)在存在或不存在Pgp抑制剂的情况下，Ela（0.2μ米)在37°C下持续24小时没有或存在这些应激源（缺氧）。溶酶体稳定性通过保存在完整溶酶体中的溶酶体嗜荧光团AO的活细胞免疫荧光成像进行检测。在高浓度吖啶橙溶酶体中，可见红色荧光，而较低的细胞溶质和核浓度产生绿色荧光。图像是三个独立实验的典型，在B类代表平均值±S.D(误差线) (n个= 3). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页<0.001，相对于各自的控制。††，第页<0.001，相对于单独使用Dp44mT的相应治疗。比例尺，10微米。
图12。
图12。
与常氧相比，微环境应激源在缺氧条件下更大程度地增强Pgp介导的Dp44mT细胞毒性。KB31（Pgp极低）(A类)，KBV1（+Pgp）(B类)和DMS-53（+Pgp）(C类)在控制条件下或微环境应激源葡萄糖饥饿（0μ米)、血清饥饿（无FCS）或H2O（运行）2应力（100μ米)在正常氧下(我)或缺氧(ii（ii）). 然后在相同条件下额外培养24小时/37°C，添加Dp44mT（0.2–100μ米)在存在或不存在Pgp抑制剂的情况下，Ela（0.2μ米)常压或缺氧。使用MTT增殖试验测量细胞增殖。结果是三个独立实验的典型结果，数据分析代表平均值±S.D(误差线) (n个＝3）.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页<0.001，相对于相应的Dp44mT对照。#，第页< 0.05; ##,第页< 0.01; ###,第页<0.001，相对于使用Ela的相应Dp44mT治疗。
图13。
图13。
图示肿瘤微环境应激源增加耐药性的Pgp调节的两种主要机制的示意模型。肿瘤微环境应激源(即血清饥饿、低血糖、ROS和低氧）通过两种机制诱导Pgp介导的抵抗：1）短期（1-h）应激后Pgp重新分布到溶酶体；2）长期（4-24h）应激之后通过HIF-1α增加Pgp表达，伴随溶酶体生物发生。A类，非应激（常氧）癌细胞中基础Pgp的表达；B类短期接触应激源会导致Pgp向溶酶体的重新分布迅速增加；C类长期暴露于应激源也会将Pgp重新分配到溶酶体，但通过HIF-1α和溶酶体生物发生，Pgp水平也会增加。在溶酶体内，Pgp允许Pgp底物进入该细胞器。D类从治疗的角度来看，应激因素会降低药物敏感性/毒性(即通过增加Pgp表达和Pgp介导的溶酶体药物捕获增加对DOX的耐药性(即溶酶体“安全屋”效应）。与DOX相比，肿瘤微环境应激增加了Dp44mT对Pgp表达细胞的药物敏感性/毒性。值得注意的是，这些应激源诱导Pgp介导的对DOX的耐药性，而Dp44mT直接利用Pgp克服这种耐药性并杀死肿瘤细胞。
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