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.2018年2月1日；159(2):1130-1146.
doi:10.1210/en2017-03065。

CRISPR/Cas9–介导的Tspo基因突变导致MA-10小鼠肿瘤Leydig细胞线粒体膜电位和类固醇形成降低

锦江扇 1, 王凯文（Kevin Wang） 1, 巴里·齐尔金 2, 瓦西里奥斯·帕帕佐普洛斯 1 三
附属公司

CRISPR/Cas9–介导的Tspo基因突变导致MA-10小鼠肿瘤Leydig细胞线粒体膜电位和类固醇形成降低

锦江扇等。 内分泌学. .

摘要

线粒体外膜转运体蛋白（TSPO）以高亲和力结合胆固醇，并参与介导其传递到线粒体，这是激素诱导类固醇生成的速率限制步骤。与TSPO结合的特定配体已被证明可启动类固醇形成。然而，最近关于Tspo基因缺失的研究提供了相互矛盾的结果。在这里，我们使用CRISPR/Cas9系统，通过检测Tspo特异性突变对激素和环磷酸腺苷（cAMP）反应性MA-10细胞类固醇形成的影响，来解决和扩展先前的研究。两个突变亚细胞系nG1和G2G分别携带Tspo外显子2特异性基因组修饰，两个对照亚细胞系G1和HH分别携带野生型Tspo。作为对二丁酰cAMP的反应，nG1和G2G细胞产生的孕酮水平显著低于相应的对照细胞G1和HH产生的孕激素水平。为类固醇生物合成提供游离胆固醇的中性脂质稳态在Tspo突变细胞中显著改变。有趣的是，与对照细胞相比，Tspo突变细胞的线粒体膜电位（ΔΨm）显著降低，可能是因为Tspo与线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道和微管蛋白相互作用。在nG1细胞中诱导了类固醇生成性急性调节蛋白（STAR）的表达，表明TSPO的减少影响了STAR的合成和/或加工。综上所述，这些结果为TSPO在类固醇生物合成中的关键作用提供了进一步证据，并表明其可能至少部分通过调节ΔΨm和对STAR的影响发挥作用。

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数字

图1。
图1。
CRISPR/Cas9介导的筛选和验证Tspo公司突变MA-10小鼠Leydig细胞。（A） 克隆的gRNA1和克隆的gRNA 2设计在Tspo公司密码子ATG后的基因。Exon2-R和Exon2-F是用于筛选突变基因组DNA的引物。（B） 外显子2及其侧翼序列如图所示。红色，gRNA1；绿色，gRNA2；橙色，gRNA1和gRNA2之间的间隙。粗体字母，外显子2；小写字母，内含子序列。（C，D）FACS对转染（C）gRNA1和（D）gRNA2两种质粒构建物的Mito-H细胞[MA-10细胞表达Mito-roGFP（28）]进行24小时的细胞分选。结果图显示了散点图中的四个细胞亚群：G1/nG1（Q1），即缺乏Mito-roGFP的转染细胞；G2G（Q2），表达Mito-roGFP的转染细胞；表达Mito-roGFP的基础（Q3）细胞；和HH（Q4），Mito-roGFP表达较高的细胞。CRISPR/Cas9–介导的突变细胞nG1和G2G中TSPO的（E–L）免疫荧光（IF）染色，分别与WT细胞G1和HH进行比较。使用激光扫描共聚焦显微镜和表观荧光显微镜对WT细胞[（E）和（G）用于G1；（I）和（K）用于HH]和突变细胞[（F）和（H）用于nG1。用兔单克隆抗TSPO抗体和Alexa Fluor标记TSPO®546共焦图像用红色表示驴抗狂犬病IgG（E、F、I和J），荧光图像用黄色表示（G、H、K和L）。面板E、F、I和J中突出显示区域的原始图像如所示补充图2（H，L）显示了红/蓝的合并通道，其中只有少数G2G细胞对TSPO或背景染色具有非常弱的染色；用DAPI将细胞核复染成蓝色。线粒体用MitoTracker复染TM公司深红色FM，涂成绿色，Mito-roGFP也以蓝色显示HH和G2G单元。比例尺：共焦图像为5μm，外荧光图像为100μm。DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；IgG、免疫球蛋白-G。
图2。
图2。
基因组结构、预测的截短肽、有缺陷的类固醇生物合成和中性脂质稳态改变Tspo公司突变细胞nG1和G2G。（A） nG1、G2G和WT的基因组序列比对Tspo公司CRISPR/Cas9靶区周围的位点。虚线表示nG1细胞中26个核苷酸的缺失，G2G细胞中4个核苷酸的缺失。（B） 预测nG1、G2G和WT细胞中突变TSPO的肽。第二种可能的蛋氨酸（M60）似乎存在于突变的nG1和G2G细胞中。虚线表示为序列比对引入的缺口或预测突变蛋白中缺失的氨基酸。红色箭头表示TSPO双拓扑模型中形成共价结合的两个酪氨酸之一。（C，D）干扰nG1与G1细胞中刺激的孕酮生成：（C）对照组与（D）dbcAMP治疗组。（E，F）G2G与HH细胞中刺激性孕酮生成减少：（E）对照组与（F）dbcAMP治疗组。结果显示平均值±平均值标准误差（SEM；n=4）。（G–K）TSPO缺乏导致dbcAMP处理后细胞内胞浆中性脂质积累增加。（G，H）LDs包括dbcAMP治疗前和治疗后G1细胞（G）中尼罗红染色的酯化胆固醇。（I，J）LDs包括dbcAMP治疗前和治疗后nG1细胞（I）中尼罗红染色的酯化胆固醇。红色箭头以白色表示代表性LD。（K） 所用细胞中每个细胞的LDs定量：G1对照，G1与dbcAMP处理，nG1对照和nG1与db2AMP处理。结果显示为平均值±SEM（n=386）*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）<0.001（学生）t吨测试。无意义。
图3。
图3。
TSPO缺失影响线粒体膜结构和形态。（A-F）G1和nG1细胞中的活线粒体用Mitotracker Red CMXRos（Invitrogen）染色，这取决于Δψ米dbcAMP治疗前（A，D）和治疗后（B，E）。（C，F）dbcAMP处理后，G1细胞中线粒体染色扩散的放大区域被突出显示，这可能与与类固醇生成相关的线粒体融合有关（34）；nG1细胞线粒体染色呈“气球状”或肿胀状，表明线粒体形态或Δψ米TSPO耗尽后。（G–J）透射电镜观察（A–F）所示相同细胞的固定线粒体。索引，根据参考条以假彩色绘制突出显示区域的强度。（G，H）G1细胞线粒体双膜屏障清晰可见，但dbcAMP处理后边界模糊。（I，J）然而，在nG1细胞中，OMM和IMM之间的接触点清晰可见（黄色箭头和线条）；cAMP刺激后，细胞膜被清楚地视为线粒体和细胞质之间的边界。线粒体球体（Msp）或有丝分裂（Mtp）也被指出。红色箭头表示线粒体（Mt）；显示嵴膜。
图4。
图4。
TSPO缺乏减少Δψ米（A）通过PerkinElmer EnSpire多模平板阅读器获得1-mM dbcAMP处理前后G1和nG1的JC-10红/绿荧光强度比值。（B–E）相应细胞的高含量图像：来自分子器件ImageXpress Micro XLS宽场高含量分析系统的G1（对照组vs dbcAMP）和nG1（控制组vs db2AMP）。红色（540/570 nm），健康线粒体；绿色（485/534nm），去极化或凋亡细胞。（F） 评估Δψ米TSPO缺乏细胞：G2G vs WT细胞：HH。在FCCP处理前后绘制TMRE荧光强度图（以消除Δψ米)，其中G2G细胞具有较低的Δψ米WT细胞与nG1细胞相同。结果显示平均值±标准误差（n=24）*P（P）< 0.05; ***P（P）<0.001（学生）t吨测试。
图5。
图5。
减少的Δψ米在TSPO缺乏的细胞中，TSPO具有特异性。TSPO配体PK 11195（Sigma-Aldrich Canada Ltd.）和XBD173（Tractus Chemical）增加Δψ米 通过TSPO。（A） 增加Δψ米PK 11195处理后的对照G1细胞。100 nM PK 11195影响Δψ米仅在G1细胞中，不在TSPO-缺乏的nG1细胞。（B） 增加Δψ米G1对照细胞经20-μM XBD173处理后；20μM XBD173影响Δψ米仅在G1细胞中，不在TSPO-缺乏的nG1细胞。（C） 恢复坍塌Δψ米PKA抑制剂H-89（10μM；Sigma-Aldrich）和H-89（1和10μM）对TSPO-缺乏细胞的影响Δψ米G1和nG1细胞。H-89（10μM）显著增加了Δψ米（D，E）PK 11195（100 nM）和XBD173（20μM）处理后，Mito-roGFP监测的线粒体氧化还原状态无影响。然而，TSPO-deficient细胞保持较高的线粒体氧化状态。（F） dbcAMP处理TSPO-deficient细胞后，线粒体氧化还原状态无影响，但对照细胞保持显著降低的状态。结果显示平均值±标准误差（SEM；n=24）。（G） PK 11195-刺激类固醇生成。对照HH细胞和TSPO突变G2G细胞用和不用PK 11196（100nM）处理2小时。用放射免疫法测定孕酮的生成。结果显示为平均值±SEM（n=4）*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）<0.001（学生）t吨测试。不另作说明，无意义。
图6。
图6。
TSPO介导Δψ米减少通过VDAC-管蛋白相互作用。微管蛋白稳定剂紫杉醇（Sigma-Aldrich Canada Ltd.）增加Δψ米 通过TSPO。（A） 增加Δψ米在100-nM紫杉醇处理对照G1细胞后，但TSPO缺乏的nG1细胞缺乏反应。（B） 重大变化Δψ米在100-nM紫杉醇处理对照HH细胞后，但TSPO-deficient G2G细胞无反应。（C） 在MA-10细胞中，包括微管蛋白在内的细胞骨架蛋白参与了dbcAMP诱导的类固醇生成。在带1至9中发现的线粒体蛋白复合体中鉴定出微管相关蛋白，而线粒体蛋白复合物中肌动蛋白丝相关蛋白增加。质谱数据摘自之前关于TSPO介导的胆固醇线粒体转运复合物的研究（11）。（D） TSPO相关的细胞骨架蛋白-蛋白质相互作用。主要交互从STRING数据库中检索(http://string-db.org)除了VDAC与微管蛋白的相互作用来自于先前发表的关于二聚体微管蛋白在负电位下阻断VDAC闭合的文章（40）。（E–J）共焦成像（E–G）控制G1细胞和（H–J）TSPO-deficient nG1细胞中聚合小管和线粒体重叠。面板（E）和（F）中的插图标识面板（G）中所示的区域，面板（H）和（I）中的插件标识面板（J）中所显示的区域。细胞用MitoTracker Red CMXRos（Invitrogen；Ex/Em:579/599）染色20分钟，然后用Thermo Fisher Scientific TubulinTracker™Green（俄勒冈州绿®488双醋酸盐紫杉醇；Ex/Em:494/522 nm），持续30分钟。（K） G1（左）和nG1（右）单元格中两个通道的散点图和条形图显示了Mander的重叠系数(R（右）)作为聚合小管和线粒体之间共定位的测量值***P（P）<0.001（学生）t吨测试。无意义。
图7。
图7。
TSPO参与STAR的功能和/或线粒体导入。（A，C）对对照组（G1和HH细胞）和TSPO缺乏细胞（nG1和G2G）经dbcAMP（1 mM）处理和不经dbcAMP处理2小时的细胞裂解液中的TSPO进行免疫印迹分析。在G1和HH细胞中可以看到TSPO的稳健表达。nG1细胞无TSPO表达；在G2G细胞中可见弱TSPO表达。（B，D）对对照组（G1和HH细胞）和TSPO-缺陷细胞（nG1和G2G）经dbcAMP（1 mM）处理和不经dbcAMP处理2小时的裂解液中的STAR进行免疫印迹分析。通过去除nG1细胞中的TSPO诱导免疫反应性STAR蛋白。使用抗-甘油醛-3-磷酸脱氢酶（36 kDa）复制用于TSPO的相同膜，而使用抗-Cox IV（16 kDa。凝胶照片是使用生物凝胶成像仪拍摄的。（E–J）用于验证STAR蛋白线粒体导入的STAR-DsRed融合蛋白的共焦图像。面板（E）中的插图标识了（F）和（G）中所示的区域，面板（H）中的插件标识了面板（I）和（J）中所显示的区域。与线粒体靶向蓝色荧光蛋白和Mitotracker深红色Fm染色相比，STAR-DsRed蛋白（G）在对照G1细胞的线粒体外显著定位，但（J）在nG1 TSPO缺乏细胞的线粒体内定位更多，在线粒体外定位更少。（K） 经1mM dbcAMP处理后，STAR-DsRed导入对照G1细胞线粒体；（五十） 然而，在突变的nG1细胞中，仍有大量蛋白质留在线粒体外。STAR线粒体输入可能与Δψ米(45, 46). 白色箭头表示STAR-DsRed融合蛋白（红色）（F、G、I和J）在线粒体表面或（K）在线粒体内的分布。比例尺：5μm。M、 蛋白质阶梯。
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