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.2018年1月3日；13（1）：e0189711。
doi:10.1371/journal.pone.0189711。 2018年eCollection。

恶性特性增强的非锚固、治疗侵袭性神经母细胞瘤瘤球的分子和功能分析：放射治疗耐药性的可能解释

塔马拉J Abou-Antoun 1 2, 爪哇纳粹主义者 三 4, 安东尼·加尼姆 5, 斯坦尼斯拉夫·武克马诺维奇 2, 安东尼·德·桑德勒 2 6
附属公司

恶性特性增强的非锚固、治疗侵袭性神经母细胞瘤瘤球的分子和功能分析：放射治疗耐药性的可能解释

塔马拉J Abou-Antoun等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

尽管癌症治疗和管理取得了显著进展，但60%以上的神经母细胞瘤患者以转移性和侵袭性疾病的形式表现出预后极差。包括神经母细胞瘤在内的实体瘤被认为是异质性的，其干细胞亚群具有高度恶性的治疗侵袭性。我们之前在神经母细胞瘤细胞培养中发现了锚定依赖性（AD）细胞和锚定非依赖性（AI）肿瘤球之间的可逆适应性可塑性（RAP）现象。为了扩大AI肿瘤球的分子特征，我们试图定义小鼠AD和AI神经母细胞瘤细胞的综合蛋白质组。比较两个表型细胞群体的蛋白质组图谱，以确定差异蛋白质表达和感兴趣的分子途径。我们报告了与AD癌细胞相比，AI肿瘤球表达的致瘤途径的唯一或显著上调。这些途径控制着转移潜能、恶性肿瘤增强和上皮-间充质转化。此外，放射治疗诱导了特定致瘤和增殖蛋白的显著上调，即survivin、CDC2和Poly[ADP-核糖]聚合酶1。AI肿瘤球的生物功能特征对受体酪氨酸激酶（RTKs）的缝合抑制以及通过细胞存活、增殖、凋亡和迁移评估的2.5 Gy放射治疗具有抵抗力。有趣的是，PDGF-BB对PDGFRβ的刺激导致AI肿瘤球中EGFR和VEGFR的反式激活作用强于AD细胞。PDGFRβ的持续抑制消除了这两种细胞类型中的这种反式激活。此外，48 h缝合治疗显著下调AI肿瘤球中PDGFRβ、MYCN、SOX2和Survivin的蛋白表达，并抑制肿瘤球的自我更新。当缝合线治疗与survivin敲除相结合时，AI肿瘤球的放射敏感性增强。我们的结论是，与AD癌细胞相比，AI肿瘤球具有不同的蛋白表达，这有助于其恶性表型和抗辐射性。为了改善神经母细胞瘤患者的预后，需要针对这两种细胞表型。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。蛋白质组分析揭示了AI肿瘤球和AD神经2a细胞之间差异表达的蛋白质的功能类别。
（A） 与NB-AD粘附细胞相比，AI肿瘤球由高度参与小分子生物化学、RNA翻译后修饰以及能量生成和代谢的蛋白质组成。（B） String Functional Protein pathway分析揭示了AI肿瘤球中致瘤蛋白之间的联系，特别强调了HDGFR和RhoA通路及其与其他致瘤蛋白的关联相互作用。HDGFR相关蛋白参与有丝分裂和DNA结合活性，并可能在细胞增殖和分化以及组蛋白甲基化中发挥作用；而RhoA附属蛋白在参与细胞粘附、迁移和侵袭的GDP-GTP交换和Rho-GTP活化中起关键作用。
图2
图2。蛋白质组分析中确定的特定蛋白质的蛋白质印迹验证。
蛋白质印迹分析用于验证蛋白质组分析中确定的一些靶点。CDC2在AD细胞中的蛋白表达比AI肿瘤球高2倍，而PARP1、SOX2和HDGFR在AI肿瘤中的表达比AD细胞高1.5倍以上。此外，MIA3、RhoA、PDGFRβ、VEGFR和EGFR的表达水平也显著高于对照组(P<0.05)通过Western blot分析确定，AI肿瘤球中含量较高。*表示P值<0.05.结果表示多次实验的平均值±SEM。
图3
图3。与AD癌细胞相比，AI肿瘤球表现出对放射治疗的抵抗。
（A） AD细胞（黑条）具有显著的(*P<0.05)使用7AAD/Annexin V染色评估单次剂量（2.5 Gy）辐射后2天，与AI肿瘤球（白色条）相比，凋亡率更高。（B） 与对照细胞相比，与AI肿瘤球（72%至52%）相比，AD细胞在辐射后72小时的增殖标记Ki-67表达降低更为明显（81%至38%）。AI肿瘤球中Ki-67%受照/对照细胞的平均比率为0.75，而AD细胞的平均比例为0.45，这是根据4个独立实验的平均值得出的，这些实验分为三次进行，并呈现了多次实验的±SEM。（C） 与AD细胞（右侧）相比，AI肿瘤球（左侧）在放射后96小时内显示出更多的活细胞，这是通过计算活细胞（非rypan蓝染色）和非活细胞（台盼蓝染色）来确定的，用于支持XTT细胞增殖分析。（D） 辐射/对照神经母细胞瘤AD细胞（黑条）和AI肿瘤球（白条）的平均比率是根据四个独立实验的吸光度得出的，实验分为三次进行，并绘制图表。比率有显著差异(*P<0.05)在放射治疗后48、72和96小时（2.5 Gy），AD细胞和AI肿瘤球之间，表明与AD细胞相比，AI肿瘤细胞球具有抗辐射性。（E） 与人工智能肿瘤球相比，放射治疗后AD细胞表现出更高的细胞死亡，如人工智能肿瘤细胞球的照片所示，放射治疗72小时后AD细胞显示出与人工智能瘤球相比，AD细胞中更多的死亡细胞和细胞碎片。*表示P值<0.05.结果表示多次实验的平均值±SEM。
图4
图4。AI肿瘤球和AD细胞在放射后表现出survivin、PARP 1和CDC2的显著上调。
将AI肿瘤球或AD细胞照射（+）（2.5 Gy）或保留未处理（-），照射48 h后将细胞溶解，并用SDS-page凝胶分离蛋白质进行Western blot分析。与未经治疗的对照组相比，照射AI肿瘤球和AD细胞后，Survivin显著上调。此外，与未经治疗的对照组相比，照射AI肿瘤球和AD细胞后，PARP 1显著上调。此外，CDC2是一种增殖标记物，与AI肿瘤球相比，AD细胞明显过度表达，与未经处理的细胞相比，照射后48小时，AI肿瘤细胞球和AD细胞均显示出显著上调。*表示P值<0.05.结果表示多次实验的平均值±SEM。
图5
图5。使用缝合线对PDGFRβ的小分子抑制显著增加AD细胞中的细胞死亡并抑制细胞增殖和迁移。
（A） 与未处理的对应物相比，NB-AI肿瘤球（白条）对不断增加的sutent处理浓度表现出显著的耐药性，这是在处理48小时后使用细胞毒性分析进行评估的，而AD细胞（黑条）与未处理的对应物相比，细胞死亡呈剂量依赖性增加。（B） 得出了NB-AI肿瘤球和AD细胞的处理/对照吸光度的平均比值，并将其绘制为±SEM。与未处理的肿瘤球相比，AI肿瘤球（白条）在24、48、48小时内对sutent诱导的细胞增殖减少具有显著的抗性，处理后72和96小时，而AD细胞（黑条）在缝合处理后显示出与未处理的对应物相比细胞增殖的显著减少，如使用WST-1细胞增殖测定法测定的。（C） “伤口愈合”试验用于评估PDGF-BB（10 ng）诱导NB AD细胞的细胞迁移，在“伤口诱导”前用苏门汀处理1小时。缝合线显著抑制AD细胞在24小时后迁移进入和闭合伤口的能力。平均吸光度表示为各组之间的“折叠式变化”；未经刺激、未经处理的细胞（对照组）归一化为1，而PDGF-BB诱导的迁移（对照组+BB）和缝合线诱导的PDGF-BB刺激迁移抑制（缝合线+BB。与未刺激对照组相比，PDGF-BB刺激导致AI（白色条）和AD（灰色条）细胞迁移显著增加（*）。缝合线治疗显著废除（#）(P<0.05)PDGF-BB诱导AD细胞（灰条）迁移到腔室下侧的能力（Fold-change from 1.65 to 1.2），但对AI肿瘤球（白色条）的跨西迁移能力只有轻微但不显著的影响（Fold-chance from 1.75 to 1.65）。*表示P值<0.05.结果表示多次实验的平均值±SEM。
图6
图6。Sutent抑制PDGFRβ的磷酸化和EGFR/VEGFR反激活。
（A） 与NB AD细胞相比，AI肿瘤球的Western blot分析显示，用10 ng PDGF-BB刺激AI肿瘤细胞球5分钟后，PDGFRβ和下游信号级联（Akt）显著磷酸化（B），在0.2μM缝合线预处理1h后，该磷酸化显著抑制。与AI肿瘤球（A和B）相比，AD细胞受PDGF-BB刺激的影响较小。此外，经PDGF-BB刺激5分钟后，AD和更强大的AI细胞表现出EGFR和VEGFR的反激活作用，而这两种反激活作用在苏门汀预处理1小时后被消除（A和B）。*表示P值<0.05.结果表示多次实验的平均值±SEM。
图7
图7。Sutent联合survivin敲除对抑制细胞迁移和侵袭以及增强AI放射敏感性有额外的作用。
（A） 经0.2μM sutent和survivin敲除处理的NB AD细胞与单独处理的细胞相比，通过“伤口愈合”试验评估，其对细胞迁移的抑制作用更强。（B） 与单独使用缝合线或未经处理的对照组相比，联合使用缝合线（0.2μM）和survivin敲除处理的AI肿瘤球（白色条）显示PDGF-BB（+）介导的细胞侵袭能力显著降低。单独用sutent处理的AD细胞（黑条）在PDGF-BB（+）介导的细胞侵袭中表现出抑制作用，与survivin敲除结合也会增强这种抑制作用。（C） 与单独使用Survivin基因敲除相比，与缝合线治疗联合使用时，AI肿瘤球中的Survivin-know-down基因敲除在放射治疗后对细胞增殖的抑制作用更强，从而提高了放射敏感性。（D） Western blot分析证实siRNA转染48小时后测量到的neuro2a AD细胞和AI肿瘤球中survivin蛋白表达显著降低。*表示P值<0.05.结果表示多次实验的平均值±SEM。
图8
图8。AI肿瘤球中的长期缝合治疗抑制致瘤蛋白表达和肿瘤球自我更新。
将AI肿瘤球用0.2μM缝合线处理48 h，然后裂解进行Western blot分析。A） 典型实验的Western blot图像显示，48 h缝合治疗后PDGFRβ、MYCN、SOX2和Survivin的表达降低。B） 多个Western blot实验的密度分析显示上述蛋白质的蛋白质表达在统计学上显著降低。C） 肿瘤圈自我更新能力的显微图像超过15天，用0.2μM缝合线治疗抑制。*表示P值<0.05。结果表示多个实验的平均值±SEM。
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