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.2018年1月1日;8(1):169-184.
doi:10.7150/thno.21234。 2018年eCollection。

人脐血外显子通过miR-21-3p介导的血管生成和成纤维细胞功能促进皮肤伤口愈合

附属公司

人脐血外显子通过miR-21-3p介导的血管生成和成纤维细胞功能促进皮肤伤口愈合

尹虎等。 治疗诊断科技. .

摘要

血浆在软组织伤口愈合中的应用近年来受到越来越多的关注。外泌体是关键的旁分泌介质,可从生物流体(包括血浆)中获得,并能通过转移生物活性分子(如microRNAs(miRNAs))诱导再生效应。本研究旨在研究人脐血血浆外泌体(UCB-Exos)对伤口愈合的影响并阐明其潜在机制。方法:通过超速离心分离UCB-Exos,并将其皮下注射到小鼠全层皮肤伤口中。通过测量伤口闭合率、组织学分析和免疫荧光检查评估UCB-Exos对伤口愈合的疗效。体外定量实时PCR(qRT-PCR)分析检测一类在调节伤口愈合中发挥积极作用的miRNA的表达水平。通过划痕试验、transwell试验和细胞计数kit-8分析,评估UCB-Exos对人皮肤成纤维细胞和内皮细胞迁移和增殖的影响。采用试管形成实验检测UCB-Exos对内皮细胞血管生成试管形成能力的影响。同时,通过使用特定RNA抑制剂或siRNA,评估候选miRNA及其靶基因在UCB-Exos诱导的成纤维细胞和内皮细胞功能调节中的作用。结果:将UCB-Exos局部移植到小鼠皮肤伤口中可加速上皮再形成,减少疤痕宽度,增强血管生成。体外,UCB-Exos可促进成纤维细胞的增殖和迁移,增强内皮细胞的血管生成活性。值得注意的是,miR-21-3p被发现在UCB-Exos中高度富集,并通过抑制磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)和发芽同源物1(SPRY1),在UCB-Exos诱导的调节效应中起到关键介体的作用。结论:我们的结果表明,UCB-Exos是血浆活性的重要效应器,可以作为一种新的有希望的软组织伤口愈合策略。

关键词:脐血;外泌体;miR-21-3p。;伤口愈合。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益:作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
UCB-Exos的特征。(A)通过DLS分析测量UCB-Exos的粒度分布。(B)通过TEM观察到的UCB-Exos的形态。比例尺:50 nm。(C)代表性流式细胞术直方图显示UCB-Exos结合珠上存在外体表面标记CD63和TSG101。阴性对照:同型对照一抗+二抗或仅二抗。未与外泌体结合但与相应的一级和二级抗体孵育的珠子作为空白。
图2
图2
UCB-Exos移植有利于小鼠皮肤伤口愈合。(A)伤后第2天、第5天和第8天用UCB-Exos或PBS治疗的伤口的大体视图。(B)接受不同治疗的伤口闭合率。n=每组10个。(C)术后8天用UCB-Exos或PBS处理的伤口切片进行H&E染色。黑色箭头表示疤痕的边缘。比例尺:500μm。(D)瘢痕宽度和再上皮化程度的量化。n=每组3个。(E)用UCB-Exos或PBS处理的伤口切片的Masson三色染色*P(P)与PBS组(对照组)相比,<0.05。
图3
图3
UCB-Exos增强小鼠伤口部位的血管生成。(A)受伤后第8天接受不同治疗的伤口的大体视图。在伤口部位发现了新形成的血管。(B)经UCB-Exos或PBS处理的伤口切片的CD31免疫荧光染色。比例尺:50μm。(C)定量分析(B)中的血管数量。n=每组3个*P(P)与PBS组(对照组)相比,<0.05。
图4
图4
UCB-Exos将miR-21-3p传递到成纤维细胞和内皮细胞。(A)通过qRT-PCR分析检测指示miRNAs的表达。n=3。(B)HSF和HMEC对PKH67标记的UCB-Exos内化的荧光显微镜分析。受体细胞的核周区可见绿色标记的外泌体。比例尺:50μm。(C-D)与UCB-Exos孵育3 h的HSF和HMEC显示miR-21-3p的表达水平高于对照组。每组n=3。用UCB-Exos孵育24小时降低了HSFs中PTEN和SPRY1的表达(E)和HMEC(F).n=每组3个。使用浓度为100μg/mL的UCB-Exos*P(P)与PBS组(对照组)相比,<0.05。
图5
图5
UCB-Exos通过转移miR-21-3p促进成纤维细胞的增殖和迁移。(A)划痕试验分析表明,UCB-Exos促进HSF迁移,但miR-21-3p抑制剂可降低这种影响。比例尺:250μm。(B)定量分析(A)中的迁移率。n=每组3个。(C)transwell实验进一步证实了接受不同处理的HSF的迁移能力。比例尺:100μm。(D)定量分析(C)中迁移的细胞。n=每组3个。(E)CCK-8分析显示,UCB-Exos促进HSFs增殖,而miR-21-3p抑制减弱了这种作用。n=每组4个。(F)UCB-Exos降低了HSF中PTEN和SPRY1的表达,但其下调被miR-21-3p抑制剂逆转。n=每组3个。(G)UCB-Exos孵育提高了HSF中p-Akt和p-Erk1/2的蛋白水平,而miR-21-3p联合治疗组则降低了这一影响。(H)(G)中相对带强度的密度定量。n=每组4个*P(P)与对照组相比<0.05,# P(P)与UCB-Exos(100μg/mL)组相比,<0.05。
图6
图6
抑制PTEN和SPRY1诱导UCB-Exos-like对成纤维细胞功能的阳性作用。(A)通过qRT-PCR验证了靶向PTEN和SPRY1的siRNA的抑制效率。n=每组3个。(B)用划痕法检测不同治疗组HSF的迁移。(C)定量分析(B)中的迁移率。n=每组3个。(D)CCK-8分析不同治疗组HSF增殖情况。n=每组4个*P(P)与PBS组相比<0.05,# P(P)与对照(Con)siRNA组相比,<0.05。
图7
图7
MiR-21-3p介导UCB-Exos对内皮细胞的促血管生成作用。根据划痕试验分析,UCB-Exos诱导HMEC的运动显著增加,但miR-21-3p抑制剂降低了促凝血作用(A-B)(比例尺:250μm)和跨阱分析(C-D)(比例尺:100μm)。每组n=3。(E)通过CCK-8分析评估接受不同处理的HMEC的增殖情况。n=每组4个。(F)UCB-Exos增加了HMEC的成管能力,但这种作用因miR-21-3p抑制而减弱。比例尺:100μm。(G)(F)中总分支点和总管长度的定量分析。n=每组3个。(H)通过qRT-PCR分析检测PTEN和SPRY1的表达。n=每组3个。(I)western blotting检测Akt和Erk1/2的磷酸化水平。n=每组4个*P(P)与对照(Con)siRNA组相比<0.05,# P(P)与UCB-Exos(100μg/mL)组相比,<0.05。
图8
图8
抑制PTEN和SPRY1对内皮细胞诱导UCB-Exos-like促血管生成作用。(A)通过qRT-PCR验证了靶向PTEN和SPRY1的siRNA的抑制效率。n=每组3个。(B)通过划痕试验测试HMEC在不同治疗组中的迁移。(C)定量分析(B)中的迁移率。n=每组3个。(D-E)不同治疗组HMEC管形成的代表性图像和量化。n=每组3个。(F)不同治疗组HMEC增殖的CCK-8分析。n=每组4个*P(P)与PBS组相比<0.05,# P(P)与Con-siRNA组相比,<0.05。

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