跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2018年1月4日；69（1）:9-23.e6。
doi:10.1016/j.molcel.2017.11.033。 Epub 2017年12月28日。

拓扑异构酶3α对人mtDNA的脱位和分离是必需的

托马斯·尼克尔斯 1, 克里斯蒂娜·纳达卢蒂 2, Elisa Motori公司 3, 尤恩·W·索默维尔 4, 格里因·斯戈曼（Gráinne S Gorman） 4, 斯瓦拉吉·巴苏 1, 艾米丽·霍伯格 1, 道格·M·特恩布尔 4, 帕特里克·F·吉尼 5, 尼尔斯·戈兰·拉尔森 6, 埃里克·拉尔森 1, 玛丽亚·法尔肯伯格 1, 罗伯特·泰勒 4, 杰克·D·格里菲斯 2, 克莱斯·M·古斯塔夫森 7
附属公司

拓扑异构酶3α对人mtDNA的脱位和分离是必需的

托马斯·尼克尔斯等。 分子电池. .

摘要

线粒体DNA复制是如何终止的，新形成的基因组是如何分离的，目前尚不清楚。我们在此证明拓扑异构酶3α（Top3α）的线粒体亚型实现了这一功能，其作为Holliday连接重溶BLM-Top3 a-RMI1-RMI2（BTR）复合物的组成部分独立于其核作用。我们的数据表明，mtDNA复制终止是通过在H链复制起点形成的半萜烷发生的，Top3α对解决这种结构至关重要。衰变是线粒体网络内线粒体DNA分离单元（核仁）分离的先决条件。这一过程的重要性在TOP3A双等位基因致病性变体引起的线粒体疾病患者中得到了强调，以肌肉限制性线粒体DNA缺失和慢性进行性外眼肌麻痹（CPEO）+综合征为特征。我们的工作将Top3α确定为mtDNA复制机制的基本组成部分和mtDNA分离机制的第一个组成部分。

关键词：DNA复制；DNA分离；线粒体；核仁；进行性眼外肌麻痹；隔离；拓扑异构酶。

PubMed免责声明

利益冲突声明

权益声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。Top3α的缺失影响mtDNA的维持
（A） 通过分离细胞组分的western印迹对拓扑异构酶进行线粒体定位。HeLa细胞被分为细胞核/未破裂细胞、胞浆、整个线粒体和有丝分裂体。线粒体和有丝分裂体部分用蛋白酶K进行额外处理，以去除外部结合蛋白。使用的标记蛋白为组蛋白H3（细胞核）、TFAM（线粒体基质）和凋亡诱导因子（AIF；膜间间隙）。（B） 通过HeLa细胞裂解物的western blotting评估Top3α、Top2α和Top2β的消耗效率。β-actin用作负荷控制。星号（*）表示非特异性物种。（C） 通过HeLa细胞线粒体裂解物的western blotting评估Top1mt耗竭效率。电压依赖性阴离子通道（VDAC）用作负载控制。（D） 拓扑异构酶siRNA缺失后mtDNA拷贝数和7S DNA水平的Southern blot分析，如（B）和（C）所示。使用BamHI对mtDNA进行线性化，并使用探针（a）进行检测。28S rDNA用作加载控制。（E） 拓扑异构酶siRNA缺失后平均mtDNA拷贝数和7S DNA水平的量化（n=3）。误差条代表SEM。
图2
图2。病理学Top3α变异与线粒体DNA结构改变有关
（A） Top3α的结构域，表示已鉴定的复合杂合变异体的位点。MTS表示线粒体靶向序列，罗马数字表示保守结构域。（B） 定量单纤维实时PCR显示，大多数（但不是全部）COX缺陷纤维表现出高水平的克隆扩增mtDNA缺失，涉及MTND4型基因，多重线粒体DNA缺失的标志。数据表示Top3α患者的中值±SEM。（C）DNA重排。线条代表预测的mtDNA缺失（蓝色）或重复（红色）区域。Top3α患者骨骼肌DNA的（D和E）Southern blot分析表明存在高分子量mtDNA结构。用BamHI（D）在主弧中或用PvuII（E）在副弧中切割DNA，用琼脂糖分离，并用探针（a）（用黑条表示）进行印迹。（F） 用于生化表征的纯化Top3α变体。共分离出8 pmol的每种蛋白质，并在Mini-PROTEAN TGX无染色凝胶（Bio-Rad）上进行检测。（G） EMSA评估Top3α变异体与5′放射性标记80-nt ssDNA寡核苷酸的结合。总的来说，在37°C温度下，10 fmol ssDNA与不断增加的Top3α（0、107.5、215、430和860 fmol）孵育15分钟，然后用8%的PAGE分离。（H） DNA松弛试验。总共，200 ng负超螺旋pBluescript II SK（+）质粒DNA与越来越多的Top3α蛋白（1.75、5和10 pmol）在37℃孵育45分钟，然后在1%琼脂糖上分离并在UV光下成像。Nt.BspQI（缺口内切酶）处理代表缺口（开环）DNA和大肠杆菌TopoI治疗代表松弛、共价闭合DNA的迁移。–EtBr凝胶通道下方的数字表示完全松弛基质的百分比，Nt.BspQI处理的样品（通道1）设置为100%。
图3
图3。Top3α的M100V变体显示催化活性受损
（A） 拓扑异构酶siRNA缺失后的mtDNA拓扑。未切割的DNA（3μg）在低百分比琼脂糖上分离、印迹，并使用探针（a）检测。BamHI处理的DNA标志着线性mtDNA和大肠杆菌TopoI-处理的DNA标志着松弛的、开放的圆形mtDNA的迁移。（B） Top3α缺失细胞中高分子量mtDNA物种的酶分解。如有指示，DNA经过处理大肠杆菌分离前使用Topo I、S1核酸酶或T7内切酶I。（C和D）Top3αsiRNA诱导的mtDNA连锁表型的拯救。用编码野生型（WT）或催化失活型（Y362F）稳定转染Flp-In T-REx 293细胞TOP3A公司cDNA为全长（FL）或N末端截短（Δ25）形式。使用2 ng/mL四环素在对照siRNA-处理细胞（1-5通道）或Top3αsiRNA--处理细胞（6-10通道）中诱导表达。（C） Top3α缺失和siRNA-resistant结构表达的Western blot。β-actin用作负荷控制。箭头表示Top3α的两种形式（细胞核和线粒体）。星号（*）表示非特异性物种。（D） 样品mtDNA的Southern blot，如（C）所示。使用BamHI限制总DNA样本（3μg），用琼脂糖分离，印迹，并使用探针（a）检测。28S rDNA用作加载控制。
图4
图4。Top3α的缺失诱导线粒体DNA儿茶酚胺的形成
（A和B）来自对照siRNA处理的细胞的单体开环形式mtDNA（A）和单体超螺旋mtDNA（B）的代表性EM图像。比例尺，200纳米。（C和D）来自Top3α缺失细胞的连锁mtDNA的典型EM图像，示例图像1（C）和示例图像2（D）。比例尺，0.5 mm。（E）来自Top3α/Top1mt缺失细胞的连锁mtDNA的典型EM图像。比例尺，0.5 mm。（F和G）缺失Top3α和Top1mt细胞后复制mtDNA分子的典型EM图像，示例图像1（F）和示例图像2（G）。比例尺，200纳米。（H） 根据EM分析，在指定的siRNA处理后，对单体（松弛和超螺旋）或连环拓扑形式中发现的mtDNA分子进行量化。数据以百分比表示，表示每个研究组重复进行的三个独立实验的平均值。误差条代表SEM。（I–L）患者成纤维细胞mtDNA的典型EM图像。（一） 单体开环（1n）。（J） 过冷单体mtDNA（1nsc）。（K） 由二聚体环组成的儿茶酚胺。（五十） 由三聚圆（2n+1nsc）组成的复杂悬链线。所有刻度条，200 nm。（M） 对照和患者成纤维细胞单体（开环和超螺旋）和链状mtDNA的EM定量。误差条代表SEM。数据以百分比表示，表示每个研究组两次独立实验的平均值。
图5
图5。Catenane组以OriH为中心
（A和B）X形、含NCR的线粒体DNA分子的代表性电子显微照片及其解释。用PvuII/XhoI（A）或BamHI/ClaI（B）进行限制性酶消化，产生的物种具有映射到OriH区域的臂长：PvuII/XhoI为1.8 kb/2.5 kb，BamHI/ClaI为1 kb/2.5 kb。比例尺，200纳米。（C） 使用HincII限制来自对照、Top3α或Top1mt缺失细胞的mtDNA，通过2D琼脂糖凝胶电泳分离，并使用探针（a）检测。在缺乏Top3α的细胞中，可以看到X形分子作为X弧。（D） 去除Top3α和Top1mt的细胞的总DNA用指示的酶限制，用琼脂糖分离，并用探针（b）进行印迹。只有当探测到的碎片包含分子连接时，才能看到X形分子。（E） X形物种比例的量化，归一化为相同消化的线性物种水平。黑色条表示探针。虚线表示所用限制酶的位点。基因位点和关键序列元素显示在图表上方。
图6
图6。线粒体Top3α与BTR复合物无关
（A） 通过细胞组分的western blotting对BTR复合物蛋白质组分的线粒体定位，如图1A所示。图1A再现了Top3α印迹，以供参考。（B） 通过HeLa细胞裂解物的western blotting评估BTR复合物成分的消耗效率。β-actin用作负荷控制。箭头表示Top3α的两种形式（核和线粒体）。（C） BLM、RMI1和RMI2的siRNA缺失后mtDNA拷贝数和7S DNA水平的Southern blot分析，如（B）所示。28S rDNA用作加载对照。（D） BTR复合蛋白siRNA缺失后的mtDNA拓扑结构。用低浓度琼脂糖分离未切割的DNA（3 mg），进行印迹，并使用探针（a）进行检测。BamHI处理的DNA标志着线性mtDNA和大肠杆菌TopoI-处理的DNA标志着松弛的、开放的圆形mtDNA的迁移。
图7
图7。Top3α的缺失干扰了线粒体网络内类核的分离和分布
（A） 在指示的siRNA处理后，HeLa细胞的典型共焦显微镜图像显示DNA和TOM20的合并通道（上部面板）和DNA的单通道（下部面板）。比例尺，10μm。（B） （A）中黄色方框区域的放大图显示共焦（灰色，左侧）和g-STED（绿色火焰LUT，右侧）中的成像核仁。比例尺，600 nm。（C） 在指定的siRNA处理后，量化每个细胞的核仁数。核苷酸数量以对照siRNA处理的细胞的百分比表示（来自4个独立实验，分析n≥9个细胞）。误差条代表SEM。（D）在指定的siRNA条件下，由g-STED测定的类核的平均大小。从三个独立实验分析的类核数：对照siRNA=244；Top3αsiRNA=357；Top3α+Top1mt siRNA=361；RMI1 siRNA=393。误差条代表SEM。（E）人类线粒体中Top3α作用机制的模型。在mtDNA复制后，Top3β需要解析mtDNA半链烷并分离新合成的mtDNAs。线粒体Top3α活性的丧失导致线粒体DNA连锁和核仁分离受损。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

  • Top3α是线粒体DNA复制中的复制拓扑异构酶。
    Hangas A、Kekäläinen NJ、Potter A、Michell C、Aho KJ、Rutanen C、Spelbrink JN、Pohjoismäki JL、Goffart S。 Hangas A等人。 《核酸研究》2022年8月26日；50(15):8733-8748. doi:10.1093/nar/gkac660。 核酸研究2022。 PMID：35904803 免费PMC文章。
  • 线粒体DNA复制缺陷与人类疾病。
    科普兰WC。 科普兰WC。 生物化学与分子生物学评论。2012年1月至4月；47(1):64-74. doi:10.3109/10409238.2011.632763。 生物化学与分子生物学评论。2012 PMID：22176657 免费PMC文章。 审查。
  • TOP3A中的病理变异导致线粒体和核基因组稳定性的明显紊乱。
    Erdinc D、Rodríguez-Luis A、Fassad MR、Mackenzie S、Watson CM、Valenzuela S、Xie X、Menger KE、军士K、Craig K、Hopton S、Falkous G；英国基因组研究联合会；Poulton J、Garcia-Moreno H、Giunti P、de Moura Aschoff CA、Morales Saute JA、Kirby AJ、Toro C、Wolfe L、Novacic D、Greenbaum L、Eliyahu A、Barel O、Anikster Y、McFarland R、Gorman GS、Schaefer AM、Gustafsson CM、Taylor RW、Falkenberg M、Nicholls TJ。 Erdinc D等人。 EMBO分子医学杂志，2023年5月8日；15（5）：e16775。doi:10.15252/emmm.202216775。Epub 2023年4月4日。 EMBO分子医学，2023年。 PMID：37013609 免费PMC文章。
  • RNASEH1突变损害线粒体DNA复制并导致成人线粒体脑肌病。
    Reyes A、Melchionda L、Nasca A、Carrara F、Lamantea E、Zanolini A、Lamperti C、Fang M、Zhang J、Ronchi D、Bonato S、Fagiolari G、Moggio M、Ghezzi D、Zeviani M。 Reyes A等人。 美国人类遗传学杂志。2015年7月2日；97(1):186-93. doi:10.1016/j.ajhg.2015.05.013。Epub 2015年6月18日。 Am J Hum基因。2015 PMID：26094573 免费PMC文章。
  • 线粒体中捕获的拓扑异构酶-DNA共价复合物及其在人类疾病中的作用。
    Das BB、Ghosh A、Bhattacharjee S和Bhattacheryya A。 Das BB等人。 线粒体。2021年9月；60:234-244. doi:10.1016/j.mito.2021.08.017。Epub 2021年9月6日。 线粒体。2021 PMID：34500116 审查。
查看所有类似文章

引用人

  • 生命树中IA型拓扑异构酶结构和细胞功能的变化。
    Tan K、Tse-Dinh YC。 Tan K等人。 细胞。2024年3月21日；13(6):553. doi:10.3390/cells13060553。 细胞。2024 PMID：38534397 免费PMC文章。 审查。
  • 体内诱导线粒体特异性蛋白降解系统。
    Sanyal S、Kouznetsova A、Ström L、Björkegren C。 Sanyal S等人。 国家公社。2024年2月16日；15(1):1454. doi:10.1038/s41467-024-45819-6。 国家公社。2024 PMID：38365818 免费PMC文章。
  • 线粒体DNA复制应激触发了类核处置的促炎症内体途径。
    Newman LE、Weiser Novak S、Rojas GR、Tadepalle N、Schiavon CR、Grotjahn DA、Towers CG、Tremblay MÈ、Donnelly MP、Ghosh S、Medina M、Rocha S、Rodriguez-Enriquez R、Chevez JA、Lemersal I、Manor U、Shadel GS。 Newman LE等人。 自然细胞生物学。2024年2月；26(2):194-206. doi:10.1038/s41556-023-01343-1。Epub 2024年2月8日。 自然细胞生物学。2024 PMID：38332353
  • 哺乳动物线粒体中的线性DNA驱动重组。
    Fragkoulis G、Hangas A、Fekete Z、Michell C、Moraes CT、Willcox S、Griffith JD、Goffart S、Pohjoismäki JLO。 Fragkoulis G等人。 《核酸研究》2024年4月12日；52(6):3088-3105. doi:10.1093/nar/gkae040。 核酸研究2024。 PMID：38300793 免费PMC文章。
  • 线粒体钙转运蛋白的抑制改变adp诱导的血小板反应。
    Shehwar D、Barki S、Aliotta A、Veuthey L、Bertaggia Calderara D、Alberio L、Alam MR。 Shehwar D等人。 《分子生物学报告》2024年1月22日；51(1):177. doi:10.1007/s11033-023-09116-7。 分子生物学报告2024。 PMID：38252254
查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Akman G、Desai R、Bailey LJ、Yasukawa T、Dalla Rosa I、Durigon R、Holmes JB、Moss CF、Mennuni M、Houlden H等。病理核糖核酸酶H1导致线粒体中R环缺失和异常DNA分离。美国国家科学院院刊2016；113:E4276–E4285。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Albring M，Griffith J，Attardi G.可能的膜衍生蛋白质结构与HeLa细胞线粒体DNA在其复制起源附近的关联。美国国家科学院学报，1977年；74:1348–1352。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Amati-Bonneau P、Valentino ML、Reynier P、Gallardo ME、Bornstein B、Boissière A、Campos Y、Rivera H、de la Aleja JG、Carroccia R等。OPA1突变导致线粒体DNA不稳定和视神经萎缩“plus”表型。大脑。2008;131:338–351.-公共医学
    1. Aravind L，Leipe DD，Koonin EV。拓扑素——IA和II型拓扑异构酶、DnaG型引物酶、OLD家族核酸酶和RecR蛋白中的保守催化结构域。1998年《核酸研究》；26:4205–4213.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Calvo SE、Clauser KR、Mootha VK。MitoCarta2.0：哺乳动物线粒体蛋白质的最新清单。2016年《核酸研究》；44（D1）：D1251–D1257。-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型