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.2018年1月22日；44（2）：217-232.e11。
doi:10.1016/j.devcel.2017.11.024。 Epub 2017年12月28日。

CCPG1是一种非标准自噬货物受体，对内质网吞噬和胰腺内质网蛋白沉积至关重要

马修·德·史密斯 1, 玛格丽特·哈雷 1, 阿兰·坎普 1, 吉米·威尔斯 1, 李柱铭 1, 马克·阿伦兹 1, 亚历克斯·冯·克里格希姆 1, 克里斯蒂安·贝伦兹 2, 西蒙·威尔金森 三
附属公司

CCPG1是一种非标准自噬货物受体，对内质网吞噬和胰腺内质网蛋白沉积至关重要

马修·德·史密斯等。 开发人员单元格. .

摘要

内质网选择性自噬的机制称为内质网吞噬，需要分子描述，特别是在体内。目前尚不清楚这些事件如何控制内质网蛋白平衡和细胞健康。在这里，我们确定了细胞周期进展基因1（CCPG1），一种没有已知生理作用的ER受体蛋白，作为一种非规范货物受体，通过LIR基序与哺乳动物ATG8蛋白直接结合到核心自噬蛋白，并通过离散基序独立地与FIP200结合。这些相互作用促进了内质网吞噬。CCPG1基因可由未折叠蛋白反应诱导，从而直接将内质网应激与内质网吞噬联系起来。在体内，CCPG1可防止内质网管腔蛋白聚集，从而防止外分泌胰腺的未折叠蛋白反应过度激活和组织损伤。因此，通过鉴定这种自噬蛋白，我们描述了一种意料之外的内质网吞噬的分子机制，并提供了证据表明这可能与内质网腔蛋白沉积有关。

关键词：附件8；CCPG1；内质网吞噬；FIP200；自噬；胰腺；蛋白稳定；组织稳态；未展开的蛋白质反应。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
CCPG1是一种含LIR基序的人类ATG8同源序列相互作用体（A）CCPG1结构示意图（NTD，N-末端氨基酸1–230；TM，跨膜锚定）。（B） ATG8同源基因（LC3B、LC3C和GABARAP）的GST或GST融合用于HEK293细胞转染myc-CCPG1的亲和沉淀（AP）。（C） 将GST或GST-GABARAP（mtLDS，LIR-docking site突变体）用于HEK293细胞转染myc-CCPG1-NTD的AP。（D） 细菌表达的GST或GST-CCPG1 NTD蛋白在谷胱甘肽Sepharose珠上预先纯化，并在GST AP之前与纯化的His-GABARAP孵育。（E） 人类CCPG1氨基酸6–21与来自其他人类蛋白质的含色氨酸的LIR基序对齐。LIR位置0和3处的重要疏水残基以红色突出显示。（F）人类CCPG1的N末端与其他脊椎动物CCPG1蛋白质对齐（人类编号）。（G） 用显示的CCPG1 GFP融合物转染HEK293细胞，并用GST-LC3B或GST-GABARAP检测这些融合物的AP。
图2
图2
CCPG1是一种FIP200-相互作用蛋白（a）A549 NTAP（FLAG-HA）-使用抗HA抗体和免疫沉淀对CCPG1细胞进行免疫沉淀，以标记CCPG1，并进行LC-MS/MS和CompPASS分析（见STAR方法和表S1）。W截止点处的相互作用蛋白质DN（公称直径）此处显示0.8分。（B） 用抗FLAG珠对稳定表达NTAP空载体（−）或NTAP-CCPG1（+）的A549细胞进行标记CCPG1的免疫沉淀，并对指示的蛋白质进行免疫印迹。（C） 在CCPG1的裂解和内源性免疫沉淀以及随后的免疫印迹（IgG，阴性对照IgG）之前，A549细胞被EBSS饥饿或未处理1小时。（D） 用FLAG-FIP200转染HEK293细胞，并指示全长（FL）GFP-CPG1的变体（ΔNTD，氨基酸231–757）。用GFP-Trap进行免疫沉淀，用指示的抗体进行免疫印迹。（E） 重组FIP200单独与谷胱甘肽Sepharose珠培养，或与预先纯化的GST或GST-CCPG1 NTD结合珠培养。然后进行亲和沉淀（AP）和免疫印迹，以评估直接相互作用。参见图S1和表S1。
图3
图3
CCPG1中与FIP200 C末端区域（a）结合的线性肽基序的鉴定用重组FIP200探测15肽阵列（肽1-55）。间接免疫检测检测结合FIP200。与结合区A–C相对应的肽序列显示在阵列下方。用FLAG-FIP200转染（B和C）HEK293细胞，在抗myc免疫沉淀和免疫印迹（EV，空载体）之前，显示出CCPG1 NTD的myc标记缺失或截断。（D） 人类CCPG1的氨基酸97至118与脊椎动物同源序列（上部）的序列比对，或人类CCPG的氨基酸99–113和17–31的序列比对（下部）。保守的S/T和酸性残基为蓝色，疏水残基为红色。星号表示残基的进化保守。黑框表示FIR1和FIR2之间的残留物相同。（E） HeLaΔCCPG1号机组-用FLAG-FIP200转染1个细胞（图5E），显示全长myc标记CCPG1的变体（mtFIR1，S22A D23A I24A E25A；mtFIR2，S104A D105A I106A L109A），并在myc上免疫沉淀。（F） 用FLAG-FIP200（1279-1594）转染HEK293细胞，显示全长myc标记的CCPG1的变体，并在myc上进行免疫沉淀。另请参见图S1和S2。
图4
图4
用siCtrl或siCtrl转染ER（A）A549细胞将CCPG1重新引入自噬体CCPG1号机组转染后24小时，在EBSS中未经处理或饥饿1小时，然后染色以检测内源性CCPG1。对CCPG1病灶细胞进行评分（n=3，±SEM，*p<0.05，双尾配对样本t检验）。比例尺，20μm。（B） A549或A549 GFP-DFCP1细胞在EBSS中饥饿1小时，并对内源性CCPG1和标记物A549细胞进行共染色，然后通过共焦显微镜成像。箭头表示共同定位焦点。比例尺，10μm。（C） HeLa GFP-CCPG1细胞（野生型[WT]）或指示的ATG8（mtLIR）或FIP200（mtFIR1+2）结合缺陷变体饥饿，用ER跟踪器染色，并用共焦显微镜成像。按照STAR方法（n=3，±SEM，∗∗∗p<0.001，Tukey's单因素方差分析事后的，事后的测试）。比例尺，20μm。（D） HeLa GFP-CCPG1 mCherry-ER细胞饥饿，LC3B染色，然后用3D-SIM成像。左上角的面板显示了从上面观察到的细胞重建区域。最右边的面板是白色方框区域的缩放图像。下面的面板显示了沿白色虚线的横截面。比例尺，5μm和0.5μm（缩放）。（E） （D）中引入的HeLa-GFP或GFP-CCPG1细胞、WT或指示突变体被饥饿3小时并被GFP印迹（左）。通过密度测定法定量GFP：微管蛋白比率（右）（n=3，±SEM，*p<0.05，不显著，双尾t检验）。（F） HeLa-GFP或GFP-CCPG1细胞（WT或指示突变体）饥饿1小时，LC3B共染色，共焦显微镜成像。如STAR方法所述，导出了GFP病灶与LC3B共定位的皮尔逊系数。白色虚线表示GFP阳性细胞的轮廓（n=3，±SEM，∗∗∗p<0.001，Tukey's单因素方差分析事后的，事后的测试）。比例尺，20μm。（G） A549细胞未经处理或在EBSS中饥饿4小时，加入或不加入0.1μM巴非霉素A1（BafA1）并进行免疫印迹。（H） WT或Δ自动液位计5A549克隆未经处理或在EBSS中饥饿4小时并进行免疫印迹。（一） 用siRNA转染A549细胞48小时，然后饥饿和免疫印迹，如图所示（I和II分别表示LC3B的未润滑和脂化形式）。另请参见图S3。
图5
图5
CCPG1是一个UPR-Inducible Gene，可重塑ER（a）A549细胞，用指示的ER应激源处理16小时（Tun，突尼斯霉素，2.5μg/mL和Thaps，thapsigargin，0.5μM）。qRT-PCR用于CCPG1号机组（n=3，±SEM，*p<0.05，单因素方差分析后为Tukey's事后的，事后的测试）。（B） 用指示的内质网应激源（DTT，0.5或2 mM，Tun，1或2.5μg/mL，Thaps，0.5μM）处理HeLa细胞16小时，然后进行免疫印迹。（C） 如STAR方法所述，在ER跟踪器染色和共焦显微镜下，对HeLa GFP-CCPG1细胞和变体的ER外周形态进行分析。这些值表示为外周内质网的面积与细胞溶质面积的比例。白色虚线表示GFP阳性细胞的轮廓（n=3，±SEM，*p<0.05，∗∗p<0.01，Tukey's单因素方差分析事后的，事后的测试）。比例尺，20μm。（D） 用mCherry-ER转染HeLa GFP-CCPG1细胞及其变体，标记ER膜，并对LC3B进行免疫染色。如STAR方法所述，通过共焦显微镜对mCherry-ER/LC3B双阳性病灶细胞进行评分。白色虚线表示GFP阳性细胞的轮廓。箭头表示双阳性病灶（n=3，±SEM，∗∗∗p<0.001，Tukey's单因素方差分析事后的，事后的测试）。比例尺，10μm。删除（E–I）HeLa亲本细胞或CRISPR/Cas9亚克隆CCPG1型（ΔCCPG1型-1和ΔCCPG1号机组-2） 或自动液位计5(Δ自动液位计5)对CCPG1或ATG5进行（E）免疫印迹，或对ER跟踪器染色后的外周ER含量进行（F–I）分析，无论是否进行8小时0.5 mM DTT治疗。白色虚线表示由亮场图像确定的细胞轮廓（n=3，±SEM，∗∗∗p<0.001，∗∗p<0.01，*p<0.05，#不显著，Tukey's双向方差分析事后的，事后的测试）。比例尺，10μm。（J和K）HeLa亲本细胞或缺失体用EBSS饥饿指定时间，然后进行免疫印迹。（K） 通过RTN3:微管蛋白（n=4）或FAM134B:微管蛋白比率（n=3，±SEM，∗∗p<0.01，*p<0.05，#不显著，双尾t检验）。另请参见图S4。
图6
图6
胰腺蛋白质沉积缺陷Ccpg1号机组畸形小鼠（A和B）6周龄胎仔全胰脏（+/+）或Ccpg1号机组低形态的(燃气轮机/燃气轮机)对小鼠进行CCPG1免疫印迹或RNA提取和qRT-PCRCcpg1号机组（n=3对，±SEM，∗∗∗p<0.001，双尾t检验）。（C和D）从6周龄WT和Ccpg1号机组在SDS中均质化低形态小鼠。在8 M尿素+10 mM DTT中造粒、洗涤和提取不溶性蛋白质。根据可溶性组分中的蛋白质浓度对颗粒样品进行标准化，并进行无标记的LC-MS/MS定量。中位数绝对偏差分析在这里以热图的形式呈现，以显示成对小鼠（通过连接括号连接的成对小鼠）之间物种的显著变化。分泌酶呈红色，内质网腔伴侣/氧化还原酶呈蓝色。（E和F）对如上制备的洗涤剂可溶性和不溶性样品进行免疫印迹，并通过密度测定法获得不溶性和可溶性蛋白质种类的比率（n=3对，±SEM，*p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001，双尾t检验）。另请参见图S5和表S2。
图7
图7
细胞极化和内质网稳态的丧失以及随后的组织损伤Ccpg1号机组低形态外分泌胰腺（A）外分泌胰腺的腺泡单位。极化的腺泡细胞从顶端储存区向导管分泌凝缩酶（酶原）颗粒。这些酶最初是在占据细胞基底外侧区的膨胀粗内质网（rER）中合成的。（B） 用CARS成像或免疫组织化学染色检测6周龄同窝雌鼠胰腺组织中ER（蛋白质二硫键异构酶，PDI）或Ccpg1号机组低形态的(燃气轮机/燃气轮机)老鼠。点状CARS信号表示蛋白质或脂质内含物。比例尺，20μm。（C） 6周龄双胞胎胰腺的透射电子显微镜（TEM）。比例尺，5μm。在ImageJ中分析了嗜渗蛋白颗粒所占的细胞溶质面积百分比（n=4对，±SEM，*p<0.05，双尾t检验）。（D） 高倍TEMCcpg1号机组低形态小鼠显示rER扩张，许多多余内含物实际上是池内颗粒状结构（放大插图中的箭头）。比例尺，1μm。（E） 通过qRT-PCR分析6周龄同窝对小鼠胰腺中的RNA，以确定UPR诱导的转录物水平（n=4对，±SEM，*p<0.05，∗∗p<0.01，双尾t检验）。（F） 根据STAR方法（n=8，±SEM，#不显著，双尾t检验），分析32日龄小鼠胰腺血浆中的循环淀粉酶水平。（G） 用qRT-PCR分析6周龄一窝对小鼠胰腺RNA中显示的胰腺腺泡细胞分化相关转录物水平（n=4对，±SEM，#不显著，双尾t检验）。（H） 40周龄小鼠代表性样品的H&E染色。箭头突出了在抄送第1页低形态小鼠，在放大的面板中，经常在这种浸润的中心观察到死亡的腺泡细胞。比例尺，200μm。（一） 20周龄同窝小鼠（n=3对，±SEM，∗∗=p<0.01，双尾t检验）。箭头表示Ki67阳性核。比例尺，200μm。另请参见图S5-S7。
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