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.2017年12月21日；13（12）：e1007102。
doi:10.1371/journal.pgen.1007102。 eCollection 2017年12月。

高迁移率A组蛋白与哺乳动物基因组的结合是AT含量的函数

丹尼尔·科伦坡 1 2, 卢卡斯汉堡 1 三, Tuncay Baubec公司 1, 德克·舒贝尔 1 2
附属公司

高迁移率A组蛋白与哺乳动物基因组的结合是AT含量的函数

丹尼尔·科伦坡等。 公共科学图书馆-基因. .

摘要

基因组定位可以为染色质相关蛋白的潜在功能和招募信号提供信息。高迁移率组（Hmg）蛋白与组蛋白大小相似，Hmga1和Hmga2在复制正常组织和癌细胞中特别丰富。虽然已经提出了Hmga蛋白的几种作用，但我们缺乏对其基因组位置作为染色质、DNA序列和功能域的功能的全面描述。在这里，我们报道了小鼠胚胎干细胞的这种特性，其中我们引入了野生型和DNA结合域突变体的生物素标记结构。对Hmga蛋白全基因组分布的比较分析揭示了普遍结合，这一特征关键取决于功能性DNA结合域，并且由两种Hmga蛋白质共享。对这种绑定方式有指导意义的底层队列的评估将AT丰富度（定义为A或T碱基的高频率）确定为本地绑定的主要标准。此外，我们还发现，其他染色质状态，例如那些与顺调控区相连的染色质状态对干细胞和分化细胞中的Hmga结合几乎没有影响。因此，Hmga蛋白优先发现于富含at的区域，如组成异色区域，但缺少增强子和启动子，这说明其在调节单个基因方面的作用有限。根据这个模型，我们发现干细胞中Hmga蛋白的基因缺失导致有限的转录效应，并且在神经元祖细胞中结合是保守的。总的来说，我们的比较研究描述了Hmga1和Hmga2的体内结合方式，确定了蛋白质对全基因组富含AT-的DNA的偏好，并反对Hmga在调控区域的建议功能。相反，我们发现在at含量较高的区域，无论染色质修饰的局部变化如何，都有广泛的结合与富集。

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数字

图1
图1。Hmga1-2与DBD突变对照的基因组位置。
（A） 由一个强大、普遍活跃的启动子驱动的生物素标记的Hmga蛋白版本被插入一个确定的基因组位点。Hmga1-2的DBD被描述为方框。Hmga1-2的DBD突变，靶向三个AT-hook的核心RGR基序。单体GFP对照以类似的方式进行标记和插入。N末端生物素标签由BirA生物素连接酶识别，所用细胞系稳定表达该酶。随后使用链霉亲和素（SAV）介导的染色质IP，然后进行测序，以生成抗体依赖性基因组图。插入相同的基因组位置后，功能突变体的表达类似。（B） 顶部的表格显示了Hmga1、Hmga2和两个控制基因的每千基读取数和百万映射读取数（RPKM）。为了解释Hmga1假基因，进行了允许20次多重比对的绘图，报告的值可能低估了实际表达水平。Hmga2在ES细胞中不表达。底部，用亲本细胞系和表达Hmga1的细胞的全细胞裂解液的抗Hmga1Ab进行蛋白质印迹（WB）。可见代表bioHmga1的较高分子量条带，其表达水平与内源性蛋白质NP代表神经元祖细胞相当。（C） 通过免疫荧光评估内源性Hmga1（顶部集）、bioHmga蛋白（中部集）和bioGFP（底部集）的亚细胞定位。细胞核和DNA用DAPI染色。DAPI密集灶对分别用特异性抗体和SAV偶联荧光团检测到的WT和标记的Hmga蛋白均呈阳性。还描述了通过GFP通道捕获标记的GFP的亚细胞定位。GFP在ESC中染色均匀，不排除在细胞核中。DAPI通道中的标尺栏对应于10μm。（D） 对DBD突变体和WT Hmga1-2以及GFP的1kb平铺窗口中输入的Log2丰度进行主成分分析（PCA）。条形图显示了每个主成分解释的总方差的分数。第一主成分（PC1）本身解释了几乎50%的方差。（E） 每个样本的PC1得分。PC1将样本分为具有WT-DNA结合域的蛋白质和具有突变或无DBD的蛋白质。（F） PC1负荷与AT含量的散点图和皮尔逊相关性。
图2
图2。Hmga蛋白与ESC中的DNA结合，作为DNA AT含量的函数。
（A） 所有样品（包括Hmga1的复制品c）和1kb平铺窗口上AT含量的全基因组相关热图，说明复制品之间的良好再现性以及Hmga1-2与AT含量的相关性。颜色表示皮尔逊相关系数。（B） 14号染色体上所示样本的Log2比输入丰富。每个点表示10kb大小的窗口中IP对输入的丰富。间隙表示可映射性较低的区域（低于80%）。不显示数据范围的顶部和底部1%以增强可读性。（C） 条形图说明了单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸模型对每个样本的预测能力。考虑到高阶序列特征，预测能力没有显著提高。（D） 两个代表性重复的ES细胞中生物Hmga样品和AT含量之间的关系。散点图显示了AT含量与log2 Hmga1-2输入正常富集值（超过1kb平铺窗口）的对比，减去相应DBD突变体的相同富集。皮尔逊相关系数显示在顶部。（E） 简单重复的Hmga结合，at含量非常高。平均剖面图显示，在最小长度为300nts的可映射（TA）n个简单重复序列上，log2在各个DBD突变体上富集，以重复起始坐标为中心。AT内容显示为灰色（虚线）。
图3
图3。不同染色质环境和神经元祖细胞中Hmga1-2结合的不变性。
（A） 代表性Hmga1-2复制与染色质标记和AT含量的相关热图。Hmga1和Hmga2与AT含量形成单独的簇，与开放性呈弱反相关（由DNaseI评估）。颜色表示皮尔逊相关系数。（B） 箱形图显示了所示ESC复制物在启动子上的Hmga1和Hmga2信号分布（在DBD突变体上标准化log2富集），由启动子活性分开（见材料和方法）。（C） 柱状图显示了ESC和NP中Hmga1和Hmga2复制的全基因组相关性（DBD突变的log2富集）和基因组AT含量。（D） 沿着14号染色体的指定样本的DBD突变的Log2富集。每个数据点对应一个10kb的平铺窗口。为了更好的可读性，不显示数据范围的顶部和底部1%。NP剖面看起来与ES衍生剖面非常相似（另见S5F图）。
图4
图4。Hmga富集区和AT-富集DNA的基因组分布。
（A） LMR调控区DBD突变体log2富集值的平均分布。所示为Hmga1复制“a”的ESC和NP信号。平均信号（在51 nts上平滑）显示在以ESC、NP特定和本构LMR中点为中心的4kb窗口上，分别以红色、绿色和黑色显示。这表明Hmga1在组成区和细胞型特异性调节区均缺乏富集。（B） 与（A）中Hmga2的复制“A”相同。在指示的监管区域观察到的是贫化而非富集。（C） ESC中所示基因组和表观基因组特征的染色体全谱。每个数据点代表10kb平铺窗口上的信号（复制时间=平均晚/早S相比率，Lmna=DamID LaminA，Hmga=DBD突变体上的输入正常富集，H3K9me2=H3K9 me2输入富集）。（D） 复制时间、LaminA、H3K9me2、DNaseI切割频率、AT含量和Hmga1-2的全基因组相关热图，如图1C所示（10kb瓷砖窗口，颜色表示皮尔逊相关系数）。（E） 基于窗口本身和3个相邻窗口（上游和下游）的at含量的1kb窗口Hmga蛋白结合的线性模型。绘制的是按样本分组的每个空间位置的系数值。窗口本身的AT含量具有迄今为止最大的系数，相邻窗口的贡献导致预测能力的改善微不足道（参见S7E图）。
图5
图5。ESC中Hmga1缺失并不影响全局转录。
（A） Hmga1-KO和亲代细胞系的克隆原性测定。多能性克隆的三重生物复制计数（括号内），不包括所示数量的电镀单细胞。未观察到显著变化（单因素方差分析，CI 95%）。（B） ESC细胞周期分布数据的双向方差分析（n=3）排除了WT和Hmga1 KO样本之间的总体差异。只有在S阶段，才可以看到几乎不显著的差异（调节p值=0.0107）。有关详细信息，请参见材料和方法。Y轴表示门内单元的百分比。（C） WT和Hmga1 KO样品在4天时间过程中的细胞增殖数据。WT和Hmga1 KO样品中活跃复制细胞的分布在任何给定时间点都是重叠的。有关颜色参考和详细信息，请参考S10C图和材料与方法。（D） Hmga1 KO与亲代细胞系在基因水平上的转录组比较。如果基因有显著差异表达，则显示基因名称（调整后的p值<0.01，绝对fold-change至少为2）。（E） 在RepeatMasker定义的基因组重复区域，Hmga1 KO与亲本细胞系的转录组比较，不包括位于注释转录物相同或相反链上的重复（材料和方法）。重复元素显示无显著变化（调整后的p值<0.01，绝对折叠变化至少为2）。在RepeatMasker重复“名称”的水平上进行量化。
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