Impaired muscle relaxation and mitochondrial fission associated with genetic ablation of cytoplasmic actin isoforms

doi:10.1111/febs.14367

比较研究

.2018年2月；285（3）：481-500。

doi:10.1111/febs.14367。 Epub 2018年1月8日。

与细胞质肌动蛋白亚型基因消融相关的肌肉松弛受损和线粒体分裂

附属公司

¹美国明尼苏达州明尼阿波利斯市明尼苏打大学遗传学、细胞生物学与发展系。
²美国明尼苏达州明尼阿波利斯市明尼苏达大学康复医学系。
^三美国北卡罗来纳州格林维尔市东卡罗来纳大学东卡罗来纳糖尿病和肥胖研究所生理学系。
⁴美国明尼苏达州明尼阿波利斯明尼苏打大学生物化学、分子生物学和生物物理系。
⁵印第安纳大学生物系-美国印第安纳波利斯普渡大学。

PMID： 29265728
预防性维修识别码：项目编号：5799018
内政部： 14367年2月10日-111日

比较研究

与细胞质肌动蛋白亚型基因消融相关的肌肉松弛受损和线粒体分裂

艾利森·奥鲁克等。 FEBS J公司. 2018年2月.

.2018年2月；285(3):481-500.

doi:10.1111/febs.14367。 Epub 2018年1月8日。

附属公司

¹美国明尼苏达州明尼阿波利斯市明尼苏打大学遗传学、细胞生物学与发展系。
²美国明尼苏达州明尼阿波利斯市明尼苏达大学康复医学系。
^三美国北卡罗来纳州格林维尔市东卡罗来纳大学东卡罗来纳糖尿病和肥胖研究所生理学系。
⁴美国明尼苏达州明尼阿波利斯明尼苏打大学生物化学、分子生物学和生物物理系。
⁵印第安纳大学生物系-美国印第安纳波利斯普渡大学。

PMID： 29265728
预防性维修识别码：项目编号：5799018
内政部： 14367年2月10日-111日

摘要

虽然α-肌动蛋白亚型在成人横纹肌中占主导地位，但骨骼肌特异性敲除非肌肉细胞质β_细胞-或γ_细胞-肌动蛋白每一种都会引起一种轻度但进行性的肌病，其作用机制未知。利用透射电子显微镜，我们在老年肌肉特异性β_细胞-和γ_细胞-肌动蛋白KO小鼠。我们发现β_细胞-和γ_细胞-肌动蛋白在分离的线粒体相关膜制剂中得到富集，线粒体和肌-内质网之间的界面在信号传递和线粒体动力学中起重要作用。我们还测量了与缺乏β-_细胞-和/或γ_细胞-肌动蛋白。有趣的是，由于12个月大的肌肉特异性β_细胞-和γ_细胞-肌动蛋白KO小鼠。相反，我们发现12个月大的β_细胞-和γ_细胞-肌动蛋白肌特异性KO小鼠。我们的数据表明钙受损²⁺再摄取可能预示着老年小鼠SR形态学变化的发展，同时为所观察到的肌病提供了潜在的病理机制。

关键词：异构体；线粒体动力学；β-肌动蛋白；γ-肌动蛋白。

PubMed免责声明

数字

**图1。老年Actg1和Actb-KO骨骼肌肌浆网和线粒体形态的改变**
（A–I）6（A–C）、12（D–F）和22–25（G–I）个月龄的对照组、Actg1-msKO和Actb-msKO小鼠TA的纵切面。白色箭头表示正常SR，白色箭头表示扩张SR。比例尺=1µm。（P）定量显示22–25个月龄对照、Actg1-msKO和Actb-msKO小鼠TA的扩张SR（J–L）横切面的检查图像百分比。比例尺=1µm。（M-O）线粒体内部结构的高倍图像，白色箭头表示嵴。比例尺=250nm。（Q）线粒体长宽比的量化。采用Tukey事后检验进行单因素方差分析以确定显著性。**为0.01

**图2。Actg1和Actb-KO骨骼肌中的Z盘对齐无偏移**
6个月（A）和22–25个月（B）时相邻肌节对的Z盘对齐。双向方差分析确定不同基因型之间没有显著差异。

**图3。Actg1和Actb-KO骨骼肌中未改变的结蛋白丰度和定位**
（A–B）对照组和Actg1-msKO和Actb-msKO动物股四头肌中结蛋白的Western blot，以及Western blot的定量，归一化为GAPDH，并与对照样品的平均值相关。采用Tukey事后检验的单因素方差分析确定无显著差异。（C–E）代表性分离EDL肌纤维染色，结蛋白定位为绿色，DAPI定位为蓝色。比例尺=20µm。

**图4。γ的富集_细胞-和β_细胞-分离的线粒体相关膜中的肌动蛋白**
所示为相同的蛋白质印迹，印迹中含有等量的蛋白质，这些蛋白质来自于从小鼠肝脏制备分离的线粒体相关膜期间获得的组分，并用所示蛋白质的抗体染色。

**图5。γ的烧蚀_细胞-或β_细胞-肌动蛋白导致线粒体面积增加和裂变减少**
与对照组（CT）相比，Actg1 KO Actb KO和Actb/Actg1dKO MEF中的（A–F）线粒体出现拉长。比例尺=10µm。（G）每个基因型每个个体线粒体的表面积。（H）每个基因型的单个（非分支）线粒体数量。（一）每个基因型的网状（分支）线粒体数量。（J）网络线粒体每个分支的平均长度。（K）网络线粒体上的平均分支数。（L–M）。CT、Actg1 KO、Actb KO和Actb/Actg1 dKO MEF中裂变和聚变频率的定量。经Tukey事后检验确定显著性*的单因素方差分析为0.01

**图6。Actg1和Actb-KO骨骼肌线粒体中线粒体动力学蛋白的丰度不变**
Fis1（A–B）、MFN2（C–D）和OPA1（E–F）相对于对照平均值的蛋白质印迹和丰度量化。采用Tukey事后检验的单因素方差分析未发现显著差异。

**图7。Actg1和Actb-KO骨骼肌中电子传递链复合蛋白的未改变丰度**
（A）代表性的western blot显示对复合物II、III和V蛋白的免疫反应。（B）SDHA的定量，一种复合物II蛋白，免疫反应归一化为GAPDH，与Actg1-msCT或Actb-msCT平均值相关。（C） UQCR是一种复合III蛋白，免疫反应归一化为GAPDH并与Actg1-msCT或Actb-msCT平均值相关。（D） ATP5A是一种复杂的V蛋白，其免疫反应归一化为GAPDH，并与Actg1-msCT或Actb-msCT平均值相关。采用Tukey事后检验的单因素方差分析确定无显著差异。

**图8。Actg1和Actb-KO骨骼肌的线粒体功能不受影响**
（A–J）在离体腓肠肌纤维中测量的耗氧参数。（A）复杂I泄漏（CI泄漏），JO₂在丙酮酸、苹果酸和谷氨酸（状态2）存在下测量。（B）复合I呼吸速率（CI），JO₂在ADP存在的情况下测量（状态3）。（C）复合I+II呼吸速率（CI+II），JO₂在琥珀酸存在下测量。（D）复合II呼吸速率（CII），JO₂在鱼藤酮存在下测量。（E）复合IV呼吸速率，JO₂在存在抗霉素A、抗坏血酸和TMPD的情况下测量。（F）复合I控制是（JO₂综合体I+II-JO₂综合体II）/JO₂复杂I+II。（G）琥珀酸盐对照（JO₂CI+II-JO₂CI）/JO₂CI+II。（H） RCR是呼吸控制比率，是JO的比率₂CI/JO公司₂CI泄漏。（一）生化耦合效率是（JO₂CI-JO₂CI泄漏）/JO₂CI（J）E-超复合体是JO的比率₂CI+II/（JO₂CI+JO₂CII）。采用Tukey事后检验的单因素方差分析确定无显著差异。

**图9。22-25个月龄肌肉特异性Actb KO小鼠的未受影响的全身呼吸**
（A–E）22–25个月龄小鼠的全身线粒体呼吸测定。（A） O（运行）₂消费。（B） CO公司₂消费。（C）释放热量。（D） O的呼吸交换比₂至CO₂（E）移动。（F）研究中使用的小鼠的身体成分。

**图10。未更改H₂O（运行）₂Actg1和Actb KO骨骼肌的生产**
（A）琥珀酸刺激H₂O（运行）₂在没有或存在硫氧还蛋白还原酶抑制剂AF（金诺芬）和谷胱甘肽还原酶抑制物BCNU（卡莫司汀）的情况下（AF/BCNU），12个月大的动物体内的生产。（B）清除剂指数是琥珀酸盐诱导的H增加的百分比₂O（运行）₂相对于H的产量₂O（运行）₂抑制剂存在时的生产。

**图11。Actg1和Actb-KO骨骼肌松弛率受损**
（A–B）强直刺激12个月大的对照组、Actg1-msKO（A）和Actb-msKO（B）EDL肌肉的代表性等长收缩力轨迹。（C）最大等长强直收缩时产生的最大比力。（D）最大放松速率。采用Tukey事后检验进行单因素方差分析以确定显著性。^#或*为0.01<p<0.05，**为0.01<p<0.001，***为p<0.001。误差条为S.E.M。

**图12。Actg1和Actb-KO骨骼肌中未改变的SERCA 1和SR蛋白丰度**
（A）相对于对照平均值，SERCA 1免疫反应的定量标准化为GAPDH。（B）骨骼肌SR组分的小Ankyrin 1代表性western印迹。（C）通过western blot定量小分子锚蛋白1蛋白，标准化为蛋白质负荷，相对于对照平均值。（D）骨骼肌SR组分的钙螯合蛋白代表性western印迹。（E）通过western blot定量钙螯合蛋白，标准化为蛋白质负荷，相对于对照平均值。采用Tukey事后检验的单因素方差分析确定无显著差异。

**图13。Actg1和Actb-KO骨骼肌SR中未受影响的SERCA ATP酶活性**
SERCA（A）Actb-msKO在高（pCa5）钙、低（pCa8）钙和Vmax（pCa5-pCa8。通过（B）Actb-msKO的western blot测定的SERCA活性与SERCA丰度的关系。采用Tukey事后检验的单因素方差分析确定无显著差异。

**图14。12个月大的肌肉特异性Actb KO小鼠中ER应激反应途径蛋白没有上调**
Western blot显示对内质网应激途径蛋白的免疫反应。PDI（A）、BiP（B）、PERK（C）和IRE1α（D）免疫反应的定量。所有样本均按照GAPDH标准化，并与Actg1-msCT或Actb-msCT平均值相关。采用Tukey事后检验的单因素方差分析确定无显著差异。

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1. Kumar A、Crawford K、Close L、Madison M、Lorenz J、Doetschman T、Pawlowski S、Duffy J、Neumann J、Robbins J、Boivin GP、O'Toole BA、Lessard JL。通过肠平滑肌g-actin拯救心脏α-actin缺乏小鼠。程序。国家。阿卡德。科学。美国1997年；94:4406–4411。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Crawford K、Flick R、Close L、Shelly D、Paul R、Bove K、Kumar A、Lessard J。缺乏骨骼肌肌动蛋白的小鼠肌肉力量和生长缺陷降低，并在新生儿期死亡。分子细胞生物学。2002;22:5887–5896.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Schwartz R，Rothblum K。肌肉发生中的基因转换：鸡肌动蛋白多基因家族的差异表达。生物化学。1981;20:4122–4129.-公共医学
1. McHugh K，Crawford K，Lessard J.大鼠异肌动蛋白多基因家族发育和组织特异性表达的综合分析。开发生物。1991;148:442–458.-公共医学
1. Lloyd C，Schevzov G，Gunning P.将非肌肉β-和γ-肌动蛋白基因转染成肌细胞可引起内源性肌动蛋白的不同反馈调节反应。细胞生物学杂志。1992年；117:775–785.-项目管理咨询公司-公共医学

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[4] Crawford K、Flick R、Close L、Shelly D、Paul R、Bove K、Kumar A、Lessard J。缺乏骨骼肌肌动蛋白的小鼠肌肉力量和生长缺陷降低，并在新生儿期死亡。分子细胞生物学。2002;22:5887–5896.-项目管理咨询公司-公共医学

[5] Schwartz R，Rothblum K。肌肉发生中的基因转换：鸡肌动蛋白多基因家族的差异表达。生物化学。1981;20:4122–4129.-公共医学

[6] Schwartz R，Rothblum K。肌肉发生中的基因转换：鸡肌动蛋白多基因家族的差异表达。生物化学。1981;20:4122–4129.-公共医学

[7] McHugh K，Crawford K，Lessard J.大鼠异肌动蛋白多基因家族发育和组织特异性表达的综合分析。开发生物。1991;148:442–458.-公共医学

[8] McHugh K，Crawford K，Lessard J.大鼠异肌动蛋白多基因家族发育和组织特异性表达的综合分析。开发生物。1991;148:442–458.-公共医学

[9] Lloyd C，Schevzov G，Gunning P.将非肌肉β-和γ-肌动蛋白基因转染成肌细胞可引起内源性肌动蛋白的不同反馈调节反应。细胞生物学杂志。1992年；117:775–785.-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Lloyd C，Schevzov G，Gunning P.将非肌肉β-和γ-肌动蛋白基因转染成肌细胞可引起内源性肌动蛋白的不同反馈调节反应。细胞生物学杂志。1992年；117:775–785.-项目管理咨询公司-公共医学

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