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.2017年12月19日;10(12):1529-1538。
doi:10.1242/dmm.030049。

Friedreich共济失调KIKO小鼠模型中早期VGLUT1特异性平行纤维突触缺陷和小脑回路失调

附属公司

Friedreich共济失调KIKO小鼠模型中早期VGLUT1特异性平行纤维突触缺陷和小脑回路失调

洪琳等。 Dis模型机械. .

摘要

Friedreich共济失调(FRDA)是一种常染色体隐性遗传神经退行性疾病,伴有进行性共济失调,影响外周和中枢神经系统(CNS)。虽然后来的中枢神经系统神经病理学涉及小脑齿状核中大型主神经元以及谷氨酸能和GABA能突触终末的丧失,但FRDA小脑的早期病理变化在很大程度上仍不典型。在这里,我们在frataxin敲入/敲除(KIKO)FRDA小鼠模型中报告了早期小脑VGLUT1(SLC17A7)特异性平行纤维(PF)突触缺陷和小脑回路失调。与年龄匹配的对照组相比,在无症状年龄段,KIKO小鼠小脑匀浆中的VGLUT1水平显著降低,而VGLUT2(SLC17A6)水平显著升高。此外,GAD65(GAD2)水平显著增加,而GAD67(GAD1)水平保持不变。这表明无症状KIKO小鼠小脑中早期VGLUT1特异性突触输入缺陷,以及VGLUT2和GAD65突触输入的失调。免疫组织化学和电子显微镜进一步显示小脑分子层中含有VGLUT1的PF突触前终末的特异性减少,表明无症状和有症状的KIKO小鼠存在PF突触输入缺陷。此外,小脑匀浆和Purkinje神经元中的小脑蛋白水平显著降低,但小脑分子层的其他中间神经元中保留了小脑蛋白,表明这些小鼠Purkinje神经元中存在特异性小脑蛋白失调。此外,在无症状KIKO小鼠的齿状核中观察到大的主神经元中度丢失,与FRDA患者的情况类似。因此,我们的发现确定早期VGLUT1特异性PF突触输入缺陷和小脑回路失调是KIKO小鼠小脑功能障碍的潜在介质,反映了该小鼠模型中FRDA的发育特征。

关键词:小脑回路;弗里德雷希共济失调;KIKO;平行纤维突触;VGLUT1。

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利益冲突声明

竞争利益作者声明没有竞争利益或财务利益。

数字

图1。
图1。
Frataxin在小鼠小脑中的表达和分布。FXN(红色)和PV(绿色)荧光的(A-F′)共聚焦图像,与DAPI染色的细胞核(蓝色)融合图像,显示FXN在C57BL/6正常小鼠小脑皮质(A-C′)和DN(D-F′)广泛分布。(G-L′)FXN(红色)和线粒体标记ATP5A(绿色)荧光,并与DAPI染色的细胞核(蓝色)合并图像,显示FXN与ATP5A在C57BL/6正常小鼠的小脑皮层(G-I′)和DN(J-L′)中共定位。比例尺如图所示。
图2。
图2。
在C57BL/6小鼠小脑皮层,VGLUT1阳性谷氨酸能突触终末中的Frataxin和线粒体标记物ATP5A比GAD65阳性GABA能突触末梢中的含量更丰富。(A-C′)VGLUT1(绿色)和FXN(红色)荧光的共焦图像,与DAPI染色的细胞核(蓝色)合并图像,显示VGLUT1-阳性谷氨酸能突触终末中的FXN。(D-F′)GAD65(绿色)和FXN(红色)荧光,与DAPI染色的细胞核(蓝色)融合图像,显示GAD65阳性GABA能突触终末。(G-I′)VGLUT1(红色)和ATP5A(绿色)荧光,与DAPI染色的细胞核(蓝色)合并图像,显示VGLUT1-阳性谷氨酸能突触终末中的ATP5A。GAD65阳性GABA能突触终末的(J-L′)GAD65(红色)和ATP5A(绿色)免疫荧光,与DAPI染色的细胞核(蓝色)融合图像。比例尺如图所示。
图3。
图3。
在无症状和潜在症状年龄段,frataxin缺乏KIKO小鼠小脑匀浆中VGLUT1水平的特异性降低以及VGLUT2和GAD65水平的增加。小脑匀浆的蛋白质印迹和定量分析(30μg/车道),显示出生后第30天、第90天、第180天和第270天KIKO小鼠和年龄匹配的对照组的(A、B)VGLUT1、(C、D)VGLUT2或(E-g)GAD65/67水平,以肌动蛋白或GAPDH作为内部对照(n个=每个时间点的KIKO和对照小鼠为3-8)。数据为平均值±标准误差*P(P)<0.05, **P(P)<0.01, ***P(P)<0.001,双尾,未配对学生-测试。图3中的斑点被剥离,并用图7和Lin等人(2017)中的图中的多个抗体进行了重制;抗肌动蛋白和抗GAPDH分别作为负荷控制。
图4。
图4。
携带mitoDendra标记物的无症状KIKO小鼠小脑中的frataxin水平降低。(A-F′)mitoDendra(绿色)和FXN(红色)免疫荧光的共焦图像,以及与DAPI染色细胞核(蓝色)的融合图像,显示与对照小鼠(A-C,A′-C′)相比,在3月龄(P90)。比例尺如图所示。
图5。
图5。
携带mitoDendra标记物的无症状KIKO小鼠小脑ML中VGLUT1特异性PF突触输入受损。(A-F)VGLUT1(红色)和mitoDendra(绿色)荧光的共焦图像,以及与DAPI染色的细胞核(蓝色)的融合图像,显示与年龄匹配的对照小鼠(A-C)相比,P90 mitoDenda-KIKO小鼠(D-F)小脑ML(而非GL)中VGLUT免疫反应性的特异性降低。(A′-F′)高倍共聚焦图像显示,与对照小鼠(A′-C′)相比,P90 mitoDendra KIKO小鼠(D′-F′)小脑ML中VGLUT1阳性突触前终末显著减少。(G,H)与对照小鼠(G)相比,P90 mitoDendra-KIKO小鼠(H)小脑ML中VGLUT1阳性突触前终末(红色免疫荧光)的共焦图像。(一) VGLUT1阳性点状突触前终末数量显著减少(n个=两只KIKO小鼠的6节n个=三个控件的9个部分)。数据为平均值±标准误差***P(P)<0.001,双尾,未配对学生-测试。比例尺如图所示。
图6。
图6。
无症状和潜在症状KIKO小鼠Purkinje神经元小脑ML和PF突触缺陷的超微结构受损。(A-F)无症状(P150)和潜在症状(P360)KIKO小鼠(B、D、F)与对照组(A、C、E)小脑ML的电子显微镜图像。与年龄匹配的对照小鼠(A、C)相比,KIKO小鼠小脑ML超微结构受损,空腔增大,Purkinje神经元树突状分支(d)中线粒体数量减少且较小,P150(B)和P360(d)KIKO鼠Purkinje神经元树突分支棘(t)上的突触前终末(PF)减少。高丰度的PF突触终末包含圆形线粒体,并在对照小鼠(E)小脑ML的Purkinje神经元树突状分支的棘上形成突触,在P360 KIKO小鼠(F)中显著减少。比例尺如图所示。
图7。
图7。
PV水平在浦肯野神经元中特异性降低,但在无症状KIKO小鼠的ML的其他中间神经元中保留。小脑匀浆的(A,B)Western blot和定量分析(30μg/车道),显示KIKO小鼠和年龄匹配的对照小鼠小脑中P30、P90、P180和P270的PV水平以及肌动蛋白或GAPDH作为内部对照(n个=每个时间点的KIKO和对照小鼠为3-8)。数据为平均值±标准误差*P(P)<0.05, **P(P)<0.01,双尾,未配对学生-测试。图7中的斑点被剥离,并用图3和Lin等人(2017)中的图中的多个抗体进行了重制;抗肌动蛋白和抗GAPDH作为负荷控制。(C-H)PV(红色)和mitoDendra(绿色)荧光的共焦图像,以及与DAPI染色的细胞核(蓝色)的融合图像,显示与年龄匹配的对照小鼠(C-E)相比,P90 mitoDenda-KIKO小鼠(F-H)小脑皮质中的PV和mitoTendra显著减少。(C′-H′)高倍共聚焦图像显示,与对照小鼠(C′-E′)相比,P90 mitoDendra-KIKO小鼠(F′-H’)Purkinje神经元的PV显著降低,但ML的其他中间神经元(箭头)的PV无明显降低。比例尺如图所示。
图8。
图8。
无症状KIKO小鼠DN大主神经元中度丢失。(A-F)PV(红色)和mitoDendra(绿色)荧光的共焦图像,以及与DAPI染色的细胞核(蓝色)的融合图像,显示与年龄匹配的对照组(A-C)相比,P90 mitoDenda-KIKO小鼠(D-F)DN中PV阳性突触和周围主要神经元减少。(G-L)FXN(红色)和mitoDendra(绿色)荧光的共焦图像,以及与DAPI染色细胞核(蓝色)的融合图像,显示与对照组(G-I)相比,P90 mitoDendera-KIKO小鼠(J-L)DN中的大主神经元减少。(M) 定量分析显示,与对照组相比,线粒体Dendra-KIKO小鼠(J)DN中FXN阳性大主神经元数量中度但显著减少(G)(n个=3只KIKO小鼠和3只对照的9个切片)。数据为平均值±标准误差*P(P)<0.05,双尾,未成对学生-测试。比例尺如图所示。

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工具书类

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