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.2017年12月19日；15(1):54.
doi:10.1186/s12964-017-0210-1。

NFAT1调节的IL6信号与胶质瘤侵袭性表型有关

杨江 1, 盛汉 1, 文成 1, 王子勋 1, 吴安华 2
附属公司

NFAT1调节的IL6信号与胶质瘤侵袭性表型有关

杨江等。 小区通信信号. .

摘要

背景：我们以前证明局部免疫状态与胶质瘤预后相关。白细胞介素-6（IL6）被确定为与不良预后相关的重要局部免疫相关风险标志物。在这项研究中，我们进一步研究了IL6信号在神经胶质瘤中的作用和调节。

方法：在癌症基因组图谱（TCGA）、REMBRANDT数据库和临床样本中探讨IL6和IL6受体（IL6R）的表达和预后价值。在体外和体内肿瘤中检测IL6R或IL6刺激的基因敲除和过度表达的功能效应。还研究了活化T细胞1的核因子（NFAT1）对IL6R和IL6启动子活性的影响。

结果：IL6-和IL6R-高表达与间充质亚型和IDH-野生型胶质瘤显著相关，是生存率低的预测因素。IL6R基因敲除降低体外细胞增殖、侵袭和神经球形成，并抑制体内肿瘤发生。IL6R过表达或IL6刺激增强了胶质瘤细胞的侵袭和生长。TCGA数据库检索显示IL6-和IL6R的表达与NFAT1的表达相关。在胶质瘤细胞中，NFAT1增强IL6R和IL6的启动子活性，上调IL6R与IL6的表达。

结论：NFAT1调节的IL6信号有助于胶质瘤的侵袭性表型，强调免疫调节因子在胶质瘤恶性进展中的作用。

关键词：胶质母细胞瘤；胶质瘤；IL6；IL6R；NFAT1。

PubMed免责声明

利益冲突声明

道德批准和参与同意

本研究获得了中国医科大学第一医院机构审查委员会的批准，并获得了每个肿瘤组织捐赠者的书面知情同意书，他们同意使用肿瘤组织和临床数据进行未来研究。所有动物实验均按照中国医科大学动物伦理委员会指南进行，并经中国医科大第一医院机构审查委员会批准（批准号81472360）。

出版同意书

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有相互竞争的利益。

出版商备注

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

数字

图1
图1
IL6/IL6R表达与胶质瘤临床病理特征的相关性。一–b条IL6R的表达(一)和IL6(b条)根据TCGA胶质瘤的分子亚型显示。c（c）–d日IL6R的表达(c（c）)和IL6(d日)根据TCGA胶质瘤的IDH状态显示。e（电子）–（f）IL6R在TCGA胶质瘤中的预后意义(e（电子）)和GBM(（f）).克IL6R在REMBRANDT胶质瘤中的预后意义得到验证。h–iIL6在TCGA胶质瘤中的预后意义(小时)和GBM(我).j个IL6在REMBRANDT胶质瘤中的预后意义得到证实***P（P） < 0.001. 经典，CL；神经，NE；前神经，PN；间充质，ME
图2
图2
IL6和IL6R在患者来源的原发性神经胶质瘤细胞中的表达。a–b由原代培养获得的CD133阳性胶质瘤干细胞（GSCs）组成的神经球(一)粘附并分化为GFAP-或βIII微管蛋白阳性细胞(b条). 比例尺：红色 = 50μm，黄色 = 25微米。c（c）-d日定量PCR(c（c）)和western印迹分析(d日)结果表明，与经典胶质瘤细胞、神经胶质瘤细胞和神经前胶质瘤细胞相比，间充质胶质瘤细胞中IL6和IL6R mRNA和蛋白表达水平较高。e（电子）western blotting检测IL6R在不同胶质瘤细胞系中的表达**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001. 经典，CL；神经，NE；前神经，PN；间充质，ME
图3
图3
IL6R敲除抑制胶质瘤细胞的生长和侵袭。一分别转染IL6R-shRNA1、IL6R-shRNA2或对照-shRNA的M1和U87细胞中的IL6R蛋白水平通过western blot分析进行检测，并确认IL6R敲除。b条通过特异性shRNAs靶向IL6R可显著降低M1和U87细胞的增殖，这与MTS检测结果一致。c（c）显示在对照和IL6R沉默的M1细胞中使用TUNEL测定法检测细胞凋亡的代表性显微照片。比例尺 = 25微米。显示凋亡率量化的直方图。d日使用基质凝胶分析显示在IL6R-shRNA或对照-shRNA存在下M1和U87细胞侵袭的典型显微照片。比例尺 = 50微米。显示侵袭细胞数量的直方图。e（电子）使用伤口愈合试验测试M1和U87细胞在IL6R-shRNA或对照-shRNA存在下的迁移。比例尺 = 500微米。显示迁移率量化的直方图。（f）IL6R敲除降低M1和U87细胞的集落形成率。比例尺 = 50微米。克IL6R击倒对M1和U87 GSC神经球影响的典型图像。比例尺 = 50微米。直方图显示指示神经球的相对大小和数量的量化。结果显示为平均值 ± 来自三个独立实验的三份样品的SEM*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01
图4
图4
IL6R过表达增强胶质瘤细胞的生长和侵袭。一与内源性IL6R低表达的空载体转染N2细胞相比，在N2细胞中IL6R过度表达了几倍。b条MTS分析评估，IL6R过度表达显著增加了N2细胞的增殖。c（c）使用TUNEL分析检测对照组和IL6R过度表达N2细胞中凋亡细胞的典型显微照片。比例尺 = 25微米。显示凋亡率量化的直方图。d日典型的显微照片显示，IL6R在N2细胞中的过度表达导致通过基质涂层过滤器的侵袭增加。比例尺 = 50微米。显示侵袭细胞数量的直方图。e（电子）伤口愈合试验表明，IL6R在N2细胞中的过度表达促进了迁移。比例尺 = 500微米。显示迁移率量化的柱状图。（f）IL6R过表达增加了N2细胞的集落形成率。比例尺 = 50微米。克IL6R过度表达对N2 GSC神经球影响的典型图像。比例尺 = 50微米。直方图显示所示神经球的相对大小和数量的量化。结果显示为平均值 ± 来自三个独立实验的三份样品的SEM*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01之间。OE：过度表达；EV：空矢量
图5
图5
IL6R在体内肿瘤生长中的作用。一颅内肿瘤IL6R的IHC染色显示M1-IL6R-shRNA1和M1-IL6-shRNA2注射小鼠中IL6R沉默。比例尺 = 25微米。Kaplan–Meier生存曲线显示了分别注射M1-对照-shRNA、M1-IL6R-shRNA1和M1-IL6-shRNA2细胞的小鼠的生存差异。b条IL6R敲除显著抑制颅内肿瘤生长。c（c）IL6R沉默显著抑制皮下肿瘤生长。d日颅内肿瘤IL6R的IHC染色显示在N2-IL6R-OE注射小鼠中IL6R过度表达。比例尺 = 25微米。Kaplan–Meier生存曲线显示了分别注射N2-EV对照和N2-IL6R-OE细胞的小鼠的生存差异。e（电子）IL6R过度表达促进颅内肿瘤生长。（f）IL6R过度表达显著增加皮下肿瘤生长*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01
图6
图6
IL6R是IL6刺激诱导胶质瘤细胞生长和侵袭所必需的。一通过MTS分析评估不同浓度IL6刺激对M1和U87细胞增殖的影响。b条MTS分析结果表明，IL6R沉默可显著降低IL6刺激诱导的M1细胞增殖。比例尺 = 100微米。c（c）TUNEL法检测不同浓度IL6刺激对M1和U87细胞凋亡的影响。d日TUNEL分析显示IL6R的敲除显著消除了IL6在M1细胞中的抗凋亡作用。比例尺 = 50微米。e（电子）通过基质凝胶分析评估，IL6R的敲除逆转了IL6诱导的M1细胞的侵袭潜能。比例尺 = 50微米。（f）创伤愈合实验表明，IL6R沉默可显著抑制IL6诱导的M1细胞迁移。克IL6R敲除显著降低IL6处理后M1细胞的集落形成能力。比例尺 = 50微米。小时在M1 GSCs中，IL6刺激增加了神经球的大小和数量，这也主要取决于IL6R的表达。比例尺 = 50微米*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01
图7
图7
胶质瘤细胞中IL6R和IL6的表达受NFAT1的调节。一从TCGA数据集中下载IL6R、IL6和NFAT1 mRNA在胶质瘤中的表达数据并进行分析。IL6R和IL6的表达与NFAT1的表达显著相关。b条用蛋白质印迹法检测NFAT1在不同神经胶质瘤细胞中的表达。c（c）通过western blotting检测NFAT1敲低对M1和U87细胞IL6R和IL6表达的影响。d日通过western blotting检测T98G和N2细胞中NFAT1过度表达对IL6R和IL6表达的影响。e（电子）双标记免疫荧光染色显示，NFAT1下调伴随着M1细胞IL6R表达的降低，而NFAT1上调伴随着N2细胞IL6 R表达的增加。比例尺=10μm。（f）通过ELISA检测NFAT1沉默或过度表达后胶质瘤细胞无细胞上清液中IL-6的分泌水平。g-h（克-小时）NAFT1对IL6R的影响(克)和IL6(小时)启动子活性。与对照shRNA相比，沉默M1和U87细胞中的NFAT1显著降低了野生型IL6R和IL6启动子驱动的荧光素酶活性。与野生型启动子相比，NFAT1结合位点突变导致启动子活性降低。NFAT1在T98G和N2细胞中的过度表达增加了荧光素酶启动子的活性。我NFAT1与IL6R和IL6启动子的结合。当NFAT1在M1和U87细胞中沉默时，NFAT1的结合减少，而在T98G和N2细胞中过度表达NFAT1时，结合增加。j个在M1细胞中，NFAT1敲除显著抑制皮下肿瘤生长*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01
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参考文献

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