Reduced Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagy Is Required for Leptin Alleviating Inflammation in Adipose Tissue

doi:10.3389/fimmu.2017.01507

.2017年11月8日8:1507。

doi:10.3389/fimmu.2017.01507。 2017年电子收集。

瘦素减轻脂肪组织炎症需要减少内质网应激介导的自噬

鲁甘¹, 刘镇江¹, 丹罗（Dan Luo）¹, 钱仁¹, 华武¹, 李长兴¹, 朝阳¹

附属机构

采购管理信息： 29250056
PMCID公司： PMC5715390
内政部： 10.3389/fimmu.2017.01507

瘦素减轻脂肪组织炎症需要减少内质网应激介导的自噬

鲁甘等。前部免疫. 2017.

.2017年11月8日8:1507。

doi:10.3389/fimmu.2017.01507。 2017年电子收集。

作者

鲁甘¹, 刘镇江¹, 丹罗（Dan Luo）¹, 钱仁¹, 华武¹, 李长兴¹, 朝阳¹

附属

¹西北农林科技大学动物科学与技术学院，杨凌，中国。

采购管理信息： 29250056
PMCID公司： PMC5715390
内政部： 10.3389/fimmu.2017.01507

摘要

瘦素是一种脂肪细胞衍生的激素，在挑战条件下维持脂肪功能。自噬对维持细胞内环境稳定和调节脂肪组织特性也至关重要。然而，瘦素对脂肪细胞自噬的影响尚不明确。在这里，我们通过脂肪组织的转录组测序证明了内质网（ER）应激和瘦素与自噬和炎症相关。瘦素介导的自噬抑制与内质网应激蛋白（如Chop、GRP78和Atf4）的上游减少有关，因为使用药理学方法阻断自噬对衣霉素诱导的内质网胁迫没有影响。此外，我们确定KLF4型，潜在的转录因子附件4是瘦素介导的自噬调节脂肪细胞炎症所必需的。重要的是，ATF4与ATG5发生物理相互作用，随后形成复合物促进脂肪细胞自噬。进一步的分析显示，自噬体的核心成分Atg5是瘦素介导自噬的靶点。此外，瘦素通过减少脂肪细胞自噬介导的IκB降解，减轻内质网应激诱导的炎症。外源性瘦素治疗还能改善白脂肪组织的自噬和炎症对象/对象老鼠。总之，我们的结果表明，瘦素通过负性调节脂肪细胞中的Atf4/Atg5复合物来抑制内质网应激介导的自噬和炎症。这些发现为干预自噬以预防或治疗肥胖引起的哺乳动物代谢综合征确定了一种新的潜在手段。

关键词：附件4/附件5；脂肪细胞；自噬；内质网应激；炎症；瘦素。

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数字

图1
瘦素治疗产生与衣霉素治疗不同的转录特征，并由与小鼠脂肪自噬和内质网（ER）应激相关的诱导基因定义。**（A）**RNA-seq数据中基因集的基因本体（GO）分析(n个 = 3).（B）瘦素治疗后基因组中的转录因子家族(n个 = 3).（C）TM治疗后基因组中的转录因子家族(n个 = 3).（D）与自噬和炎症相关的基因表达水平的变化，在RNA-seq分析中发生了显著变化(n个 = 3). 值是指 ± 扫描电镜*第页 < 与车辆组相比0.05，^#第页 < 与衣霉素（TM）组相比，0.05，^&第页 < 与瘦素组比较，0.05。

图2
瘦素治疗可减少内质网应激诱导的自噬，并减轻小鼠脂肪组织中炎症细胞因子的分泌。小鼠注射衣霉素（TM）或瘦素，白色附睾脂肪组织（eWAT）或血清用于本研究(n个 = 6).（A）采用Western blot分析检测瘦素敏感性标记物（Janus kinase 2磷酸化（JAK2）和信号转导子和转录激活子3（STAT3））。**（B）**内质网应激标志物C/EBP同源蛋白的基因表达水平(印章)，葡萄糖调节蛋白78(*GRP78级*)，激活转录因子4(*附件4*)和肌醇需求酶1(*爱尔兰共和国1*).（C）经TM或瘦素处理的eWAT的代表性电子显微照片（30000×）。右边显示的图表是EM图像中自噬体平均数量的量化。**（D）**通过LC3I转化为LC3II来评估自噬，通过Western blot分析检测Beclin1、Atg5和SQSTM1的蛋白水平。**（E）**酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清白细胞介素（IL）-18水平。**（F）**ELISA检测血清IL-1β水平。图S3中包含了未截取斑点的完整扫描。价值是手段 ± 扫描电镜*第页 < 0.05,^#第页 < 与TM组相比，0.05。

图3
瘦素通过减少小鼠脂肪细胞中LC3II的周转和SQSTM1的降解来减少内质网（ER）应激诱导的自噬流量。**（A）**典型的荧光显微照片显示，转染GFP-LC3质粒并用Lyso-tracker红染色的脂肪细胞中形成了GFP-LC3puncta。细胞用衣霉素（TM）或瘦素处理。细胞核用蓝色DAPI染色(n个 = 3).（B）脂肪细胞的典型电子显微照片（30000×）。黄色箭头：内质网，红色箭头：线粒体，蓝色箭头：自噬体(n个 = 3).（C）MDC染色监测自噬体形成的典型图片。流式细胞术分析细胞自噬(n个 = 3).（D）典型的Western blot显示瘦素或TM处理的脂肪细胞中LC3II和SQSTM1的蛋白质水平，然后用400 nM巴非霉素A1（BafA1），添加于最后4个治疗期的h(n个 = 3). 图S3中包含了未截取斑点的完整扫描。值是指 ± 扫描电镜*第页 < 与对照组相比，0.05，^# 第页 < 与TM组相比，0.05，^& 第页 < 与BafA1组相比，0.05。

图4
瘦素介导的自噬和炎症涉及小鼠脂肪细胞内质网应激的上游激活。用4-苯基丁酸（4-PBA，5 2的mM h）或3-甲基腺嘌呤（3-MA，50 mM代表1 h），然后与重组瘦素孵育24小时 h或衣霉素（TM）12 小时(n个 = 3).（A）C/EBP同源蛋白的基因表达谱(印章)，葡萄糖调节蛋白78(*GRP78级*)，和激活转录因子4(*附件4*)用或不用4-PBA处理的脂肪细胞。**（B）**典型的Western blot显示经或不经4-PBA处理的脂肪细胞中LC3II、SQSTM1和Atg5的蛋白质水平。**（C）**促炎细胞因子的基因表达谱，如*IL-18、Tnfα*、和*IL-1β*用或不用4-PBA处理的脂肪细胞。**（D）**典型的Western blots显示经或不经3-MA处理的脂肪细胞中LC3II、SQSTM1和Atg5的蛋白质水平。**（E）**基因表达谱*印章，GRP78*、和*附件4*在用或不用3-MA处理的脂肪细胞中。**（F）**基因表达谱*IL-18、Tnfα*、和*IL-1β*在用或不用3-MA处理的脂肪细胞中。图S3中包括未剪切斑点的完整扫描。值是指 ± 扫描电镜*第页 < 与对照组相比，0.05，^#第页 < 与TM组相比，0.05，^&第页 < 与4-PBA组或3-MA组相比，0.05。

图5
瘦素的过度表达抑制了小鼠脂肪细胞的自噬。**（A）**注射或不注射瘦素的小鼠白附睾脂肪组织（eWAT）转录组火山图(n个 = 3个）。强调了个体内质网（ER）应激、自噬和炎症标志基因。红色：上调，蓝色：下调。**（B）**基因表达水平瘦素感染pAd的脂肪细胞-瘦素或si-瘦素(n个 = 3).（C）感染pAd的脂肪细胞中Janus激酶2（JAK2）磷酸化、信号转导子和转录激活子3（STAT3）、C/EBP同源蛋白（Chop）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和激活转录因子4（Atf4）的蛋白水平-瘦素或si-瘦素(n个 = 3).（D）在pAd存在下，表达GFP-LC3的脂肪细胞中GFP-LC3-点状结构的代表性图片-瘦素或si-瘦素用TM预处理，然后用或不用巴非霉素A1（BafA1）培养。脂肪细胞中的细胞核用蓝色DAPI染色(n个 = 3).（E）显示感染pAd的脂肪细胞中LC3II和SQSTM1蛋白水平的典型蛋白质印迹-瘦素或si-瘦素用TM预处理，然后用BafA1处理或不处理的(n个 = 3). 图S3中包含了未截取斑点的完整扫描。值是指 ± 扫描电镜*第页 < 与对照组相比，0.05，^&第页 < 与BafA1组相比，0.05。

图6
瘦素信号对于内质网应激诱导的小鼠脂肪细胞自噬和炎症至关重要。用pAd预感染脂肪细胞-瘦素或si-瘦素与衣霉素（TM）孵育，然后用4-苯基丁酸（4-PBA，5 2的mM h）或3-甲基腺嘌呤（3-MA，50 mM代表1 h）(n个 = 3).（A）通过单丹西卡德韦（MDC）染色监测脂肪细胞中有无3-MA治疗的自噬体形成的代表性图片。细胞核用蓝色DAPI染色。**（B）**典型的Western blots显示经或不经3-MA处理的脂肪细胞中LC3II、SQSTM1和Atg5的蛋白质水平。**（C）**经或不经3-MA处理的脂肪细胞中炎症标记物的基因表达。**（D）**典型的Western blots显示经或不经4-PBA处理的脂肪细胞中LC3II、SQSTM1和Atg5的蛋白质水平。**（E）**经或不经4-PBA处理的脂肪细胞中炎症标记物的基因表达。图S3中包含了未截取斑点的完整扫描。值是指 ± 扫描电镜*第页 < 与对照组相比，0.05，^&第页 < 与3-MA组或4-PBA组相比，0.05。

图7
瘦素减少内质网应激通过激活转录因子4的阻断(*附件4*)小鼠脂肪细胞的转录。**（A）**Krüppel样因子4的基因表达(*KLF4型*)在与衣霉素（TM）或瘦素孵育的脂肪细胞中(n个 = 3).（B）双荧光素酶报告分析*KLF4型*和*附件4*用PGL3-basic或PGL3转染细胞-*附件4*质粒和pc-*KLF4型*质粒(n个 = 3).（C）Atf4和KLF4的染色质免疫沉淀（ChIP）分析(n个 = 3).（D）基因表达水平*KLF4、Atf4、Chop、Beclin1、Atg5、IL-18*、和*IL-1β*感染pAd的脂肪细胞-*KLF4型*或si-*KLF4型*是否与瘦素一起孵育(n个 = 3).（E）目标基因网络的图形表示。蛋白质-蛋白质相互作用的生物信息学分析。**（F）**Atg5与Atf4互动。对HA-Atg5和His-Atf4转染的HEK293细胞进行免疫共沉淀（Co-IP）分析。**（G）**在pAd中进行Co-IP分析-*附件5*和pAd-*附件4*以未感染的转染脂肪细胞为对照。值是指 ± 扫描电镜*第页 < 与TM组相比，0.05，^#第页 < 与瘦素治疗组比较，0.05。

图8
激活转录因子4（Atf4）与Atg5形成复合物，并驱动瘦素介导小鼠脂肪细胞的自噬。脂肪细胞预先感染pAd-*附件5*或si-*附件5*用衣霉素（TM）孵育，然后用或不用瘦素治疗(n个 = 3).（A）代表性荧光显微照片显示，转染GFP-LC3质粒的脂肪细胞中形成GFP-LC3-点状结构，并用Lyso-tracker红染色。细胞核用蓝色DAPI染色。**（B）**显示Atg5、LC3II和SQSTM1蛋白水平的代表性蛋白质印迹。**（C）**基因表达*Tnfα、IL-1β*、和*白介素-18*脂肪细胞中。值是指 ± 扫描电镜*第页 < 与TM组相比，0.05，^#第页 < 与瘦素组比较，0.05。

图9
自噬相关基因5（Atg5）在自噬介导的脂肪细胞炎症中激活IκB信号通路。脂肪细胞感染pAd-*附件5*与衣霉素（TM）孵育，然后进行或不进行3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理(n个 = 3).（A）MDC染色监测自噬体形成的典型图片。**（B）**的基因表达*Tnfα，IL-18*、和*IL-1β*.（C）磷酸化IκB、NLRP3、IL-1β和IL-18的蛋白水平。**（D）**细胞质中的IκB和GAPDH蛋白水平以及脂肪细胞核提取物中的P65和PCNA蛋白水平。图S3中包括了未切割斑点的完整扫描。值是指 ± 扫描电镜*第页 < 与TM组相比，0.05，^#第页 < 与3-MA治疗组相比，0.05。

**图10**
瘦素的使用减少了脂肪组织的自噬和炎症体内.来自**（A–D）**野生型（WT）小鼠和*对象/对象*给小鼠注射衣霉素™，然后用重组瘦素蛋白或不用重组瘦素酶蛋白治疗(n个 = 6).（A）小鼠的体重。**（B）**Krüppel样因子4的基因表达水平(*KLF4型*)，C/EBP同源蛋白(印章)，葡萄糖调节蛋白78(*GRP78级*)，激活转录因子4(*附件4*)和肌醇需求酶1(*爱尔兰共和国1*)小鼠白附睾脂肪组织（eWAT）。**（C）**用Western blot检测小鼠eWAT中LC3I向LC3II的转化以及Atg5、Beclin1和SQSTM1的蛋白水平。**（D）**基因表达水平*IL-18、Tnfα*、和*IL-1β*小鼠eWAT。发件人**（E–G）**用TM和4-苯基丁酸（4-PBA）对WT小鼠进行预处理，然后用重组瘦素蛋白或不用瘦素蛋白处理(n个 = 6).（E）小鼠eWAT中ER应激标记的基因表达。**（F）**典型的蛋白质印迹显示小鼠eWAT中Atg5、LC3II和SQSTM1的蛋白质水平。**（G）**基因表达*Tnfα，IL-18*、和*IL-1β*在小鼠的eWAT中。发件人**（H–J）**用TM和雷帕霉素对WT小鼠进行预处理，然后用重组瘦素蛋白与否进行处理(n个 = 6).（H）典型的蛋白质印迹显示小鼠eWAT中Atg5、LC3II和SQSTM1的蛋白质水平。**（一）**小鼠eWAT中ER应激标记的基因表达。**（J）**基因表达*Tnfα，IL-18*、和*IL-1β*在小鼠的eWAT中。图S3中包括了未切割斑点的完整扫描。值是指 ± 扫描电镜*第页 < 与对照组相比，0.05，^#第页 < 与瘦素组比较，0.05。

**图11**
瘦素通过对脂肪细胞中激活转录因子4（Atf4）/Atg5复合物的负调控抑制内质网（ER）应激介导的自噬和炎症。瘦素在脂肪细胞NLRP3炎症小体降解过程中对Atf4/Atg5信号的转录调控至关重要。

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