产生有效组合方案以阻断HIV-1潜伏期的化合物
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内政部： 10.15252/emmm.201708193
产生有效组合方案以阻断HIV-1潜伏期的化合物
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小分子初级筛选中使用的集成小型病毒（A1 J‐Lat Tat‐GFP）的示意图。 GFP报告基因在该细胞系中的表达受HIV-1 LTR启动子的控制。 未经处理的细胞（左面板）或经PMA处理24小时的细胞（右面板；绿色，GFP；蓝色，Hoechst；红色，PI）的阵列扫描图像。 通过使用来自CCBN、LCGC和DIVERSet库（黑色）或未处理细胞（灰色）的化合物处理产生的GFP表达的分布。 结果显示为与PMA（绿色）处理的阳性对照参考样品相关的GFP表达百分比，并由三个生物复制品测定（平均值±标准偏差， n个 =3）。
使用材料和方法中描述的A1 J‐Lat细胞系，以384孔格式筛选生物活性文库（KD2），以进行潜伏期逆转活性。 与PMA处理24小时的对照样品相比，用化合物处理产生的GFP表达的分布显示为活化百分比。 试点筛选产生的Z’因子高于0.5，表明该分析对于较大的筛选具有足够的稳定性。 高通量筛选计划概述和二次分析验证。 对包含180000个小分子的三个化合物库进行筛选，以在7/1μM浓度下阻断HIV-1潜伏期。 在相同单一浓度下重新测定时，产生GFP表达的化合物的活性从其各自供应商处重新排序，并使用LTR荧光素酶细胞系进行测定，以确认剂量-反应效应。 在第一轮筛选中确定的活性成分以上述相同的形式进行了重新测试。 在第二轮筛选中，重新确认并选择了较少数量的活性成分进行进一步分析。
A类 二次筛选分析中使用的pTY‐LAI‐荧光素酶报告病毒的示意图，其中荧光素素酶的表达受来自Jurkat的克隆系的5′LTR的控制 周转时间 含有单拷贝整合子的细胞。 B–F类 用指示的化合物浓度处理24小时的报告细胞，测量荧光素酶活性。 结果显示为相对于经PMA处理的对照组的活化百分比。 指示了每种化合物的EC50。 结果的平均值和标准误差（SE）由三个生物复制品确定( n个 =3）和技术副本。 G公司 PH化合物的化学结构图解。
尤尔卡特 Tat公司 在指定的时间点用PH01–PH05的EC50/4、EC50和EC50*4处理LTR‐荧光素酶细胞。 在治疗后测量荧光素酶活性，结果显示为相对于PMA治疗结果的激活百分比。 化合物PH01–PH05在Jurkat上的活性 Tat公司 比较24小时和48小时处理的LTR‐荧光素酶细胞。 显示了化合物的浓度。
使用ELISA测定培养上清液中IL‐2的表达。 流式细胞术检测细胞表面CD69的表达。
A–E 尤尔卡特 Tat公司 LTR‐萤光素酶细胞系用PH01–PH05的EC50/4、EC50、EC50*4单独或与300 nM SAHA、100 nM chaetocin、1μM离子霉素或10 nM PEP005联合处理。 24小时后测量萤光素酶活性，结果以相对于PMA处理结果的活化百分比表示（此处显示了每种化合物的EC50的活化百分比）。 F类 Jurkat家族 Tat公司 LTR‐荧光素酶细胞系仅用指示浓度的PEP005处理（上面板），并与PH化合物联合处理（EC50；下面板）。 24小时后测量荧光素酶活性，结果以上述活化百分比表示。
A类 PH化合物的作用通过克隆系进行分析，克隆系携带微型双荧光HIV‐1 LTR报告子md‐HIV的单拷贝整合，其中GFP由EIF‐1α内部启动子组成性表达，DsRed由5′LTR组成。 B 携带md‐HIV前病毒的细胞的荧光激活细胞分选（FACS）表明EIF‐1α‐GFP和LTR‐dsRed的表达。 md‐HIV株的刺激通常会导致GFP荧光谱的改变 + /Ds红色 − 朝向GFP + /Ds红色 + . C、 D类 将克隆11或克隆131与指定浓度的PH02（左侧面板）或PH02与10 nM PEP005（右侧面板）联合处理24 h，并通过流式细胞仪分析细胞。 结果显示，单独处理和联合处理的DsRed表达的Δ平均荧光强度（ΔMFI）和DsRed表达的倍数分别增加。 平均值和标准偏差由三个生物重复测定( n个 =3）和技术副本。 通过单向方差分析确定的统计显著性如下：**** P< 0.00005. 确切地说 P（P） 值列于附录表S1中。
使用Jurkat进行染色质免疫沉淀分析 Tat公司 LTR‐DsRed，克隆11。 用PH02和/或PEP005处理细胞24小时，并使用组蛋白H3K9‐me3（左面板）和组蛋白H3‐ac（右面板）抗体进行ChIP。 结果与ChIP和抗组蛋白H3抗体相关。 结果由三个生物重复测定( n个 = 3). 统计显著性，由配对比率确定 t吨 ‐试验，如下所示：*** P< 0.0005; **** P< 0.00005. 确切地说 P（P） 值如附录表S1所示。 使用Jurkat进行Western blot分析 Tat公司 LTR‐DsRed，克隆11，检测SP1、NF‐κB p65、IκBα、总H3K9‐me3和H3K9ac的表达。 用PH02和/或PEP005处理细胞24小时。
A类 PH02类似物（简称PH02）相关化学结构的图解 a–e ，于检查 在体外 报告细胞系的结构优化。 B、 C类 尤尔卡特 Tat公司 LTR‐荧光素酶细胞系（B），Jurkat Tat公司 LTR‐DsRed克隆11（C，左面板）和克隆131（C，右面板）用指示浓度的PH02相关类似物进行处理。 治疗24小时后测量荧光素酶活性或DsRed的整体表达。 结果分别以相对于DsRed表达阳性对照（PMA处理细胞）或∆平均荧光强度（∆MFI）的活性百分比表示。 结果的平均值和SE由三个生物重复测定( n个 =3）和技术副本。
尤尔卡特 Tat公司 用指定浓度的PH化合物处理细胞。 来自健康供体的PBMC用指定浓度的PH化合物进行处理。 用指示浓度的PH化合物与10nM PEP005组合处理来自健康供体的PBMC。
从CD4池中测定细胞内HIV-1 mRNA的表达 + 禽流感病毒感染患者的T细胞( n个 =3，附录表S4）。 结果显示，与未经处理的对照组相比，折叠诱导。 定量病毒生长试验（qVOA）用于测量患者细胞池中潜伏期HIV-1前病毒的重新激活。 在分析病毒产生之前，用指示浓度的PH02和/或PEP005处理细胞24小时。 如附录表S5所示，五种不同的CD4 + T细胞池( n个 =5）用于本分析。
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