MicroRNA-520d-5p inhibits human glioma cell proliferation and induces cell cycle arrest by directly targeting PTTG1

.2017年11月15日；9（11）：4872-4887。

2017年电子收集。

MicroRNA-520d-5p通过直接靶向PTTG1抑制人脑胶质瘤细胞增殖并诱导细胞周期阻滞

同乐志¹, 宽江^1 2, 徐秀鹏¹, 天府裕¹, 吴伟宁¹, 二聂¹, 徐洲¹, 新晋¹, 张俊霞¹, 王英一¹, 刘宁（Ning Liu）¹

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MicroRNA-520d-5p通过直接靶向PTTG1抑制人脑胶质瘤细胞增殖并诱导细胞周期阻滞

同乐志等。美国J Transl Res. 2017.

.2017年11月15日；9(11):4872-4887.

2017年电子收集。

作者

同乐志¹, 宽江^1 2, 徐秀鹏¹, 天府裕¹, 吴伟宁¹, 二聂¹, 徐舟¹, 新晋¹, 张俊霞¹, 王英一¹, 刘宁（Ning Liu）¹

附属公司

¹南京医科大学第一附属医院神经外科，中国江苏省南京市210029。
²中国江苏省宜兴市宜兴市人民医院神经外科214200。

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摘要

胶质瘤是成年人原发性恶性脑肿瘤的主要来源，具有高度侵袭性。尽管已经应用了各种治疗方法，但神经胶质瘤的治疗效果仍然很差。更好地了解致病机制对于设计有效的治疗策略至关重要。先前的研究发现miR-520d-5p与胶质瘤分级呈负相关，但其在胶质瘤进展中的作用和机制尚不清楚。在本研究中，我们报道了miR-520d-5p直接靶向垂体肿瘤转化基因1（PTTG1），并在胶质瘤中发挥抑瘤作用。采用定量逆转录PCR和荧光原位杂交（FISH）检测miR-520d-5p在胶质瘤细胞和标本中的表达。通过细胞计数试剂盒8、集落形成、5-乙炔-2-脱氧尿苷（EDU）和流式细胞术检测miR-520d-5p对胶质瘤进展的影响。通过生物信息学和荧光素酶报告子分析，我们确定PTTG1是miR-520d-3p的新的直接靶点。采用异种移植模型研究miR-520d-5p对肿瘤生长和血管生成的影响。我们发现miR-520d-5p在胶质瘤细胞系和组织中的表达显著降低。在U87-MG和LN229胶质瘤细胞中，miR-520d-5p的过度表达对细胞增殖有显著抑制作用，并伴有细胞周期G0/G1阻滞。PTTG1是miR-520d-5p的新的直接靶点，在U87-MG和LN229细胞中过度表达miR-520d-5p后，PTTG1的蛋白表达显著降低。PTTG1的过度表达逆转了miR-520d-5p对胶质瘤细胞增殖的抑制作用。体内研究证实，miR-520d-5p过度表达可延缓U87异种移植瘤的生长，同时PTTG1的表达降低。总之，这些结果提供了令人信服的证据，证明miR-520d-5p作为一种抗癌miRNA发挥作用，在抑制GBM细胞增殖中起重要作用，其抗癌作用主要通过直接抑制PTTG1表达来介导。因此，我们认为miR-520d-5p是预防胶质母细胞瘤的潜在候选药物。

关键词：PTTG1；胶质瘤；miR-520d-5p；增殖。

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没有。

数字

图1
MiR-520d-5p的表达与胶质瘤的恶性程度呈负相关。A.CGGA数据库显示，与低度胶质瘤组织相比，高级胶质瘤组织中miR-520d-5p的表达降低。B、实时PCR检测了8例非癌脑组织、12例低度恶性胶质瘤组织和19例高级胶质瘤组织中miR-520d-5p的表达，正常脑组织中的miR-520d-5p水平确实高于胶质瘤标本，并且随着肿瘤病理分级的升高而显著降低。C.miR-520d-5p在正常人星形胶质细胞（NHAs）和六种胶质瘤细胞系（U118、LN229、H4、A172、U87-MG和U251）中的表达。D.通过荧光评估NBT和GBM标本中miR-520d-5p的表达就地杂交（标尺，50μm）。

图2
miR-520d-5p的过表达抑制神经胶质瘤细胞增殖*在体外*A.转染后通过qRT-PCR分析miR-520d-5p在U87-MG和LN229细胞中的相对表达水平。B、 C.EdU分析表明，miR-520-5p上调抑制U87-MG和LN229细胞的增殖。显示了具有代表性的图像（原始放大倍数为200倍）。（**P<0.01）。D.通过CCK8分析检测到miR-520-5p的过度表达抑制了细胞增殖。数据以三次重复实验的方式表示。E、 F.使用集落形成试验评估长期细胞活力。数据以一式三份实验的方式呈现。G、 H.用流式细胞术分析转染miR-520d-5p或阴性对照（miR-ctrl）慢病毒的U87-MG和LN229细胞的细胞周期相。（**P<0.01）。

图3
MiR-520d-5p直接靶向PTTG1并负调控细胞周期相关蛋白。A.PTTG1的3'UTR中miR-520d-5p结合位点，野生型（Wt）和突变型（Mut）序列突出显示。将含有pGL3-PTTG1-3'-UTR-WT或pGL3-PT TG1-3'-UTR-Mut的miR-520d-5p和荧光素酶报告体与U87-MG和LN229细胞联合转染。所示数据代表了三个独立的实验。所示数据为三个独立实验的平均值±SD。（**P<0.01）。C、 D.通过western blotting检测PTTG1在NBTS和胶质瘤标本中的表达水平；折叠变化归一化为β-肌动蛋白。非肿瘤性脑组织（n=8）来自脑外伤手术。低级别（n=12）代表来源于I级和II级神经胶质瘤组织的样本，而高级别（n=19）代表III级和IV级神经胶质瘤组织。数据表示三个独立实验的平均值±SD。（***P<0.001）。E.Pearson对miR-520d-5p相对表达水平和PTTG1相对蛋白水平的相关分析。F.转染48 h后对U87-MG和LN229细胞中的CDC2、CDK2和cyclinE1进行Western blot分析。β-肌动蛋白作为负荷控制。

图4
下调PTTG1抑制胶质瘤细胞增殖*在体外*PTTG1阳性相关基因主要富集于细胞周期相关通路。A.U87-MG和LN229细胞中PTTG1的下调降低了CDC2、CDK2和cyclinE1的水平。B.培养96小时后，使用CCK-8试验测定增殖能力。数据表示为三次试验的平均值。C、 D.使用集落形成试验评估长期细胞活力。数据以三次重复实验的方式表示。（**P<0.01）。E、 F.使用EDU分析检测增殖细胞。显示了具有代表性的图像（原始放大倍数为200倍）。（**P<0.01）。G、 H.用流式细胞术分析转染si-PTTG1或阴性对照慢病毒的U87-MG和LN229细胞的细胞周期相。一、利用基因本体分析和KEEG通路分析对CGGA、伦勃朗和GSE4290胶质母细胞瘤样本进行相关性分析，得到J.PTTG1阳性相关基因。显示了GO数据库和KEGG通路分析的生物过程富集结果。不同生物过程的顺序取决于其富集数。K.伦勃朗胶质母细胞瘤组织中几种PTTG1相关细胞周期基因的相对表达的热图，按PTTG1表达水平排序（r>0.4）。

图5
再次引入PTTG1可逆转miR-520d-5p的抑制作用。A-C。在U87-MG和LN229细胞中存在或不存在异位miR-520d-5p或miR-ctrl表达的情况下，通过引入pcDNA3.1-PTTG1或pcDNA3.1进行拯救实验。分别或联合转染pcDNA3.1-PTTG1和miR-520d-5p的胶质瘤细胞，采用CCK-8和集落形成实验检测细胞活力。（**P<0.01）。共转染48小时后，使用EDU分析评估D-F细胞增殖潜能。（**P<0.01）。G、 H.用流式细胞术测定胶质瘤细胞的细胞周期分布。I.所示细胞中PTTG1、CDC2、CDK2和cyclinE1的Western blot分析。β-肌动蛋白作为负荷对照。

图6
MiR-520d-5p在颅内异种移植物模型中抑制肿瘤生长。A.将经miR-ctrl或miR-520d-5p慢病毒预处理的U87-MG细胞植入裸鼠脑内，根据HE组织学，LV-miRNA-520d-5p组的肿瘤体积显著缩小。B.通过Kaplan-Meier生存曲线确定总生存率，并使用对数回归检验评估差异的统计显著性。C、处死后，取小鼠脑组织，包埋，切割成石蜡切片进行免疫组织化学分析。LV-miRNA-520d-5p组PTTG1、CD31和Ki67的表达显著降低。

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