跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

点政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息,确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https(https)://确保您连接到官方网站,并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2017年10月16日;8(55):94711-94725.
doi:10.18632/oncataget.21885。 电子采集2017年11月7日。

获得性顺铂耐药H1299非小细胞肺癌和P31间皮瘤细胞的生物能量学

附属公司

获得性顺铂耐药H1299非小细胞肺癌和P31间皮瘤细胞的生物能量学

Fintan Geoghegan公司等。 Oncotarget公司. .

摘要

获得性顺铂耐药性是顺铂治疗后肿瘤的常见特征,也是暴露于顺铂的非小细胞肺癌(H1299)和间皮瘤(P31)细胞系的常见特征。为了阐明获得性顺铂耐药性的细胞基础,进行了全面的生物能量学分析。我们证明,顺铂耐药细胞的细胞耗氧量显著降低,这种降低主要是由于线粒体丰度降低导致线粒体活性降低。线粒体丰度差异由以下数据支持:抗性细胞中sirtuin 1(SIRT1)、过氧化物酶体-增殖因子激活物受体-γ协同激活物1-alpha(PGC1α)、sirtuin3(SIRT3)和线粒体转录因子A(TFAM)蛋白表达降低。与这些数据一致,我们观察到与顺铂敏感对照组相比,顺铂耐药细胞中活性氧(ROS)生成增加,缺氧诱导因子1α(HIF1α)稳定增加。我们还观察到耐药H1299细胞中AMP激酶亚单位α2(AMPKα2)转录物和蛋白表达增加。这些基因中顺铂耐药H1299细胞的mRNA表达也降低,但耐药P31细胞的模式不一致。这些基因的DNA甲基化几乎没有变化,这表明细胞没有稳定的表观遗传重组。综上所述,我们的数据表明,在获得性顺铂耐药细胞中,氧化代谢减少,线粒体丰度降低,糖酵解通量增加,ROS生成增加。这表明代谢变化是SIRT3表达减少和HIF-1α稳定增加的结果。

关键词:SIRT3;生物能量学;顺铂耐药;间皮瘤;非小细胞肺癌。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突作者声明,与本文的研究、作者身份和/或出版没有潜在的利益冲突。

数字

图1
图1。Alamar Blue活性测定法测定顺铂对H1299、H1299r、P31和P31r细胞活性的影响
细胞接种在96孔板中,密度如下(A)H1299,2000个细胞/孔;(B)H1299r,6000个/单元/孔;(C)P31,2000个细胞/孔;(D)P31r,6000个细胞/孔。用载体(0.9%NaCl)或不同浓度的顺铂(50 nmol/L-100μmol/L)处理所有细胞72 h。添加阿拉玛蓝,在黑暗中培养细胞5 h。使用微孔板阅读器在544 nm的激发波长和590 nm的发射波长下读取荧光。数据表示为载体处理对照组的细胞存活率百分比。集成电路50这些值表示将生存能力降低50%所需的药物浓度。数据表示为三个单独实验的平均值±SEM,一式三份。(E)H1299、H1299r、P31和P31r细胞的生长速度通过96孔板中2000个细胞/孔的种子细胞在72小时内进行评估。经过一段时间后,向孔中加入20μL的Alamar蓝,然后用分光光度计测量荧光。数据表示为荧光强度。数据表示为三个独立实验的平均值±SEM。使用学生t检验进行统计分析。***=p<0.001。
图2
图2。由Seahorse细胞外通量分析仪测定的H1299、H1299r、P31和P31r的全细胞耗氧率和细胞外酸化率的比较曲线
以20000个细胞/孔接种细胞,并使用Seahorse细胞外通量分析仪进行分析,其中在运行期间将寡霉素、FCCP和抗霉素A依次添加到孔中。(A)H1299和H1299r的全细胞基础耗氧率(OCR)以及(B)将抑制剂/解偶联剂添加到孔中后,测定P31和P31r细胞以及细胞OCR。(C)H1299和H1299r的全细胞细胞外酸化率(ECAR)和(D)将抑制剂/解偶联剂添加到微孔中后,测定P31和P31r细胞以及ECAR。数据表示为三个单独实验的平均值±SEM。使用学生t检验进行统计分析。***=p<0.001,**=p<0.01,*=p<0.05。
图3
图3。通过柠檬酸合成酶活性、VDAC1和细胞色素氧化酶亚基4测定的线粒体丰度比较
(A)H1299和H1299r细胞中的柠檬酸合成酶活性。(B)P31和P31r细胞中的柠檬酸合成酶活性。数据表示为三个单独实验的平均值±SEM。使用学生t检验进行统计分析。***=p<0.001,**=p<0.01。对于免疫印迹,从H1299、H1299r、P31和P31r细胞的融合培养物制备全细胞裂解物。蛋白质(90μg)在10%SDS-PAGE凝胶中溶解并转移到PVDF膜上。斑点检测VDAC1、细胞色素c氧化酶亚基4或负荷控制γ-微管蛋白。(C)来自三个独立实验的VDAC1蛋白表达的代表性印迹。(D)来自三个独立实验的细胞色素c氧化酶亚基4蛋白表达的代表性印迹。
图4
图4。通过免疫印迹分析测定线粒体生物发生蛋白SIRT1、PGC1α、TFAM和SIRT3在H1299、H1299r、P31和P31r细胞裂解物中的表达
从H1299、H1299r、P31和P31r细胞的融合培养物制备全细胞裂解物。蛋白质(90μg)在10%SDS-PAGE凝胶中溶解并转移到PVDF膜上。用斑点法检测SIRT1、PGC1α、TFAM和SIRT3或负荷控制γ-微管蛋白。图中显示了(A)SIRT1的,(B)PGC1α,(C)SIRT3、,(D)TFAM蛋白表达;每个都来自三个独立的实验。
图5
图5。H1299和H1299r细胞中稳定HIF1α和AMPK亚基α2的活性氧生成和表达
(A)以250000个细胞/孔的密度接种H1299、H1299r、P31和P31r细胞,并放置24小时。然后用10μmol/L二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)对细胞进行染色。对10000个事件进行了荧光分析。从H1299、H1299r细胞的融合培养物制备全细胞裂解物。蛋白质(90μg)在10%SDS-PAGE凝胶中溶解并转移到PVDF膜上。(B)HIF1α蛋白表达的代表性印迹。(C)来自四个独立实验的AMPK亚单位α2蛋白表达的代表性印迹。(D)四次单独测量的AMPK亚单位α2平均值条形图。使用学生t检验进行统计分析。**=p<0.01,*=p<0.05。

类似文章

引用人

工具书类

    1. Hanahan D,Weinberg RA。癌症的标志:下一代。单元格。2011;144:646–74.https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.02.013.-内政部-公共医学
    1. Pillai VB、Sundarsan NR、Kim G、Gupta M、Rajamohan SB、Pillai JB、Samant S、Ravindra PV、Isbatan A、Gupta MP。外源性NAD通过激活SIRT3-LKB1-AMP活化的激酶途径阻断心脏肥大反应。生物化学杂志。2010;285:3133–44.https://doi.org/10.1074/jbc.M109.077271.-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Zong H、Ren JM、Young LH、Pypart M、Mu J、Birnbaum MJ、Shulman GI。AMP激酶是骨骼肌线粒体生物生成对慢性能量剥夺的反应所必需的。美国国家科学院院刊,2002年;99:15983–7.https://doi.org/10.1073/pnas.252625599.-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Thomson DM、Herway ST、Fillmore N、Kim H、Brown JD、Barrow JR、Winder WW。AMP激活的蛋白激酶磷酸化CREB家族的转录因子。应用物理学杂志。2008;104:429–38.https://doi.org/10.1152/japplphysical.00900.2007.-内政部-公共医学
    1. Morozov YI,Agaronyan K,Cheung AC,Anikin M,Cramer P,Temiakov D.人类线粒体RNA聚合酶启动转录的新中间产物。核酸研究2014;42:3884–93.https://doi.org/10.1093/nar/gkt1356.-内政部-项目管理咨询公司-公共医学