The Sox2 promoter-driven CD63-GFP transgenic rat model allows tracking of neural stem cell-derived extracellular vesicles

doi:10.1242/dmm.028779

.2018年1月30日；11（1）：dmm028779。

doi:10.12242/mm.028779。

这个Sox2系统启动子驱动的CD63-GFP转基因大鼠模型可追踪神经干细胞衍生的细胞外囊泡

附属公司

¹日本国家神经病学和精神病学中心（NCNP）国家神经科学研究所实验动物资源部，地址：日本东京Kodaira Ogawa-Higashi 4-1-1号，邮编：187-8502。
²日本国家神经病学研究所精神障碍研究部，日本东京Kodaira Ogawa-Higashi 4-1-1，邮编187-8502。
^三人类疾病动物模型教育和研究设施，研究促进和支持中心，藤田卫生大学，1-98 Dengakugakukubo，Kutsukake-cho，Toyoake，Aichi 470-1192，日本。
⁴日本兵库县三田市高馆2-1号关西高馆大学科技学院生物医学化学系，邮编：669-1337。
⁵日本国家癌症中心研究所分子和细胞医学部，地址：1-1 Tsukiji 5-chome，Chuo-ku，Tokyo 104-0045。
⁶日本国家神经病学研究所退化神经疾病科，日本东京Kodaira Ogawa-Higashi 4-1-1，邮编187-8502。
⁷早稻田大学高级科学与工程学院生命科学与医学生物科学系，日本东京169-8555，新宿区大久保3-4-1。
⁸熊本大学分子胚胎学和遗传学研究所细胞调控系，日本熊本市中央区本条2-2-1号，860-0811。
⁹日本东京都中央区筑地五丁目1-1号国家癌症中心研究所分子与细胞医学部104-0045tochiya@ncc.go.jp。
¹⁰Chromocenter Inc.，6-7-4 Minatojima-minami，Chuo-ku，Kobe，Hyogo 650-0047，日本。

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这个Sox2系统启动子驱动的CD63-GFP转基因大鼠模型可追踪神经干细胞衍生的细胞外囊泡

阿亚·吉村（Aya Yoshimura）等。 Dis模型机械. 2018.

.2018年1月30日；11（1）：dmm028779。

doi:10.1242/dmm.028779。

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¹日本国家神经病学和精神病学中心（NCNP）国家神经科学研究所实验动物资源部，地址：日本东京Kodaira Ogawa-Higashi 4-1-1号，邮编：187-8502。
²日本国家神经病学研究所精神障碍研究部，日本东京Kodaira Ogawa-Higashi 4-1-1，邮编187-8502。
^三人类疾病动物模型教育和研究设施，研究促进和支持中心，藤田卫生大学，1-98 Dengakugakukubo，Kutsukake-cho，Toyoake，Aichi 470-1192，日本。
⁴日本兵库县三田市高馆2-1号关西高馆大学科技学院生物医学化学系，邮编：669-1337。
⁵日本国家癌症中心研究所分子和细胞医学部，地址：1-1 Tsukiji 5-chome，Chuo-ku，Tokyo 104-0045。
⁶日本国家神经病学研究所退化神经疾病科，日本东京Kodaira Ogawa-Higashi 4-1-1，邮编187-8502。
⁷早稻田大学高级科学与工程学院生命科学与医学生物科学系，日本东京169-8555，新宿区大久保3-4-1。
⁸熊本大学分子胚胎学和遗传学研究所细胞调控系，日本熊本市中央区本条2-2-1号，860-0811。
⁹日本国家癌症中心研究所分子和细胞医学部，地址：日本东京中央区筑地5-chome 1-1号，邮编：104-0045tochiya@ncc.go.jp。
¹⁰Chromocenter Inc.，6-7-4 Minatojima-minami，Chuo-ku，Kobe，Hyogo 650-0047，日本。

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摘要

细胞外囊泡（EV）可以通过将生物分子（包括RNA和来自释放细胞的蛋白质）转移到靶细胞来调节微环境。为了了解通过EV维持神经干细胞（NSC）生态位的分子机制，建立了一种能从NSC释放人CD63-GFP表达EV的转基因（Tg）大鼠新品系。人CD63-GFP的表达在大鼠体内得到控制Sox2系统启动子（Sox2/人CD63-GFP），在未分化的胎脑中表达。GFP信号在在体外培养的神经干细胞取自Tg大鼠胚胎脑。我们还证明胚胎NSC（eNSC）衍生的EV被人类CD63-GFP标记。此外，当我们检查EV的转移时，发现eNSC衍生的EV被纳入星形胶质细胞和eNSC，因此暗示了EV介导的NSC周围不同类型细胞之间的通信。这一新的Sox2/人CD63-GFP-Tg大鼠株应为分析NSC微环境中通过EV的细胞间通信提供资源。

关键词：CD63；胞外小泡；模型动物；神经干细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益作者声明没有竞争利益或财务利益。

数字

**图1。**
**通过将Sox2/人CD63-GFP基因转染到rESCs中生成Tg大鼠。**（A）本地化*Sox2系统*发起人包括两名*Bgl公司*II位点（左）和转基因结构（右）。（B）用Sox2/人CD63-GFP基因转染的6号rESC系的显微照片。rESCs普遍表达GFP。比例尺：300 微米。（C）通过Tg[Wistar-esTgN（Sox2/CD63-GFP）3NCCRI]雄性大鼠与Wt雌性大鼠交配获得的E14大鼠。不表达GFP的胎儿是非胎仔（i）。Tg胎儿在脊髓（ii，箭头）和端脑（ii，arrow，iii和iv）中显示出高水平的GFP荧光。比例尺：5 mm.（D）大鼠脑发育过程中SOX2、内源性大鼠CD63、外源性人CD63和copGFP的Western blot分析。裂解物从E14的端脑和E19、P4和P10的大脑皮层收集(n个=3）。β-肌动蛋白作为负载对照。误差条代表s.d(**P（P）*<0.001与E14，采用Bonferroni事后检验的单向方差分析）。

**图2。**
**Tg大鼠胚胎端脑的免疫组织学分析。**（A，B）端脑冠状面低（A）和高（B）倍放大，显示SOX2和GFP荧光的免疫反应性。（B） Tg大鼠端脑图像显示GFP信号（绿色）不仅在VZ的SOX2阳性细胞（红色）周围，而且在SOX2阴性细胞（蓝色）中，如放大图（白色方框）所示。Wt端脑未见GFP信号。比例尺：100 微米。

**图3。**
**新生Wistar-esTgN（Sox2/CD63-GFP）3NCCRI Tg大鼠主要器官中人CD63-GFP.的表达。**（A） P2（ii和iii，合并；i′-viii′，GFP）处Tg后代的图片。毛发根部位于胡须中（ii和ii′，箭头），但不位于身体中（iii和iii′，箭头所示），表达GFP荧光。皮肤、大脑、心脏、肾脏和胃显示出强烈的荧光信号，胰腺显示出较弱的荧光信号。比例尺：2 mm（i，ii，iv vii），1 mm（iii）和5 毫米（viii）。（B）内源性大鼠CD63、外源性人CD63、copGFP和SOX2在GFP阴性（−）和GFP阳性（+）后代P4组织裂解物中的表达。cbl，小脑；ctx，皮层；髋关节、海马。

**图4。**
**从Wt和2只Tg大鼠血清中分离的EV的鉴定和特征[Wistar-esTgN（Sox2/CD63-GFP）3NCCRI和Wistar-es TgN。**（A）使用NanoSight系统测定超速离心收集的EV的尺寸分布。（B） EVs中flotillin-1、大鼠CD63、人CD63和copGFP的Western blot分析(n个=2).

**图5。**
**人CD63-GFP在E14处Tg大鼠端脑eNSC分化过程中的表达和定位。**（A） eNSC增殖和分化方案示意图*在体外*（B）来自Tg大鼠的GFP阳性神经球。比例尺：50 微米。（C） eNSC分化过程中的蛋白质表达谱。在Wt和Tg大鼠细胞中检测神经元（TUJ1）、星形胶质细胞（GFAP）、少突胶质细胞（CNPase）、神经干细胞（SOX2）和突触前（syntaxin 1）及突触后（GluR1）蛋白、大鼠CD63和人CD63-GFP的标记物。实验进行了一次。（D）第0天（左侧）和第5天培养的Tg大鼠细胞中GFP的表达分化后第天（右）。免疫染色显示GFP与人CD63阳性细胞和大鼠CD63阳性信号在第0天巢蛋白和SOX2阳性未分化细胞的细胞核（蓝色）周围共同定位。第5天，在MAP2阳性、CNPase阳性和GFAP阳性分化细胞中未发现GFP信号（箭头所示）。除（C）外，所有实验均使用不同的培养物重复至少两次。比例尺：20 微米。

**图6。**
**将eNSC衍生EV转移到受体细胞*在体外*.**（A）从eNSC条件培养基收集EV的协议示意图。将eNSC作为受体细胞培养在增殖培养基中的预涂层培养皿上。（B）通过NanoSight系统从Wt和Tg大鼠细胞条件培养基中获得的eNSC-衍生EV的尺寸分布。实验进行了四次。（C）电动汽车的电子显微镜图像。比例尺：200 纳米。实验进行了一次。（D） Western印迹分析显示，除了Tg EV中的外源性人CD63-GFP外，EV标记物flotilin-1和内源性大鼠CD63在分离的EV中的表达。实验进行了一次。（E） Wt EV预先标记为PKH26（红色）或PKH67（绿色），Tg EV标记为PKH26。Wt eNSC与EV孵化8 h.此外，在转移到eNSC后，使用抗人CD63（红色）检测来自Tg细胞的EV。用巢蛋白抗体对细胞进行免疫染色（红色），细胞核周围显示PKH67信号（蓝色）。实验进行了两次。（F）将Wt和Tg EVs与Wt大鼠大脑皮层的原代星形胶质细胞孵育。Wt-EV用PKH67标记，而Tg-EV用人CD63免疫染色检测（红色）。抗GFAP抗体识别星形胶质细胞。实验进行了一次。比例尺：20 微米。

**图7。**
**体外在共培养系统中将神经球衍生的EV转移到星形胶质细胞。**（A）共同培养协议的示意图。将Wt星形胶质细胞作为受体细胞培养在微孔底部的预涂盖玻璃上，然后培养4个天，将Tg或Wt神经球放入1.0的培养插入物中 µm孔。（B）用GFP（绿色）和CD63（红色）免疫反应检测Wt星形胶质细胞中Tg神经球衍生的EV。用抗GFAP（青色）抗体对星形胶质细胞进行染色。DAPI（蓝色）显示细胞核。所有实验都是用姐妹培养物在不同的培养皿中重复的。比例尺：50 微米。

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[1] Amoh Y.、Li L.、Katsuoka K.、Penman S.和Hoffman R.M.（2005）。多功能巢蛋白阳性、角蛋白阴性的毛状隆起干细胞可以形成神经元。程序。国家。阿卡德。科学。美国102，5530-5534。10.1073/pnas.0501263102-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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